Obtención de brotes a partir de explantes foliares de violeta africana (Saintpauliaionantha)


RESUMEN

A pesar de que son pocos los sistemas conocidos para hacer organogénesis directa sin formación de callo, hay uno que si se lo realiza y es con la Violeta africana (Saintpauliaionantha), es por eso que para esta practica se ha utilizado la hoja de esta especie. Ya que sus hojas representan un alto potencial en la producción de brotes. Para esto se utilizó como medio MS, enriquecido con reguladores de crecimiento, azúcar y agar. Los resultados presentados fueron exitosos en esta practica, a pesar que hubo una leve contaminación en uno de los frascos lo que se le atribuye a una falla de siembra mas no de protocolo de desinfección al cual se le adicionó un paso con fungicida.

Palabras clave: organogénesis directa,callo,brotes

INTRODUCCIÓN

La organogénesis directa ha sido conocida durante muchos años como un sistema mediante el cual se puede formar brotes directamente de una parte de la planta sin la formación de callo esta técnica es muy deseable en trabajos de micro propagación y de conservación de germoplasma. (Dolce N et all. 2004).

Para esta practica se utiliza explantes intactos de la planta que se desea micropropagar un claro ejemplar para el desarrollo de la misma es la violeta africana Saintpaulinaionanthaapartir de explantes del peciolo o de la base foliar, como también la propagación de ciertas begonias a partir de explantes foliares. (Roca, W. Mroginski, L. 1993)

La violeta africana (Saintpauliaionantha) fue descubierta por Walter Von Saint en Tanzania a finales del siglo XIX. Actualmente, es una de las plantas de interior mas populares. La diversidad de colores que presentan las flores le dan esa cualidad llamativa (Griffith 1998).

Saintpauliaionantha es una planta herbacea perenne, baja y compacta, pubescente, de tallo ausente o muy corto, con las hojas formando una roseta de cuyo centro salen las vistosas flores. La multiplicación comercial se realiza por esquejes de hoja, aunque también se pueden propagar por semillas, siendo este método empleado en la obtención de nuevas variedades. (Revista ornamental. 2009)

Inicialmente este cultivo se reproducía por semillas posteriormente se propagó por medio de esquejes foliares. La técnica de propagación in vitro mediante el uso de segmentos de pecíolo o laminas foliares es la mas utilizada comercialmente. Esta técnica permite producir plantas jóvenes genéticamente idénticas a la planta madre y libres de patógenos. (Hurtado y Merino 1997).

La micropropagación consta de cuatro etapas secuenciales: establecimiento, proliferación o multiplicación, enraizamiento y aclimatación. Siendo la etapa de aclimatación la mascrítica ya que es donde se producen las mayores pérdidas (Hurtado y Merino 1997). Durante esta etapa las vitroplantas, después de estar en un ambiente controlado con condiciones óptimas para su desarrollo, pasan a un ambiente completamente diferente, en el cual tienen que sobrevivir por sus propios medios, absorbiendo nutrientes, y elaborando sus propios azúcares por medio del proceso fotosintético (Figueroa. 2006). En la etapa de crecimiento uno de los factores ambientales que mayor incidencia tiene sobre el porcentaje de sobrevivencia es la humedad relativa en el interior de los frascos de vidrio en los que se encuentran los explantes. (XicoXicay, 2008)

El objetivo principal de esta practica es producir organogénesis directa para la obtención de brotes, libre de contaminación para la propagación de Violeta.

MATERIALES Y MÉTODOS

Preparación del medio Murashige y Skoog(MS)

Se realizó la preparación del medio de Murashige y Skoog. Al mismo que se lo enriqueció con: 3 mg L-1 de kinetina, 0 mg L-1 de ANA y 0,8 mg L-1 de tiamina, como reguladores de crecimiento y se le adicionó 30 g L-1. de azúcar disueltos en 100 ml de agua. Se aforó con agua destilada hasta completar los 660 ml que fue el volumen requerido. Se agitó la solución y se midió el pH ajustandolo a 5,7; con la ayuda de HCl 1M o NaOH 1M y se le adicionó los 6.2 g L-1 de agar. Luego se calentó hasta que elmedio hierva; se dispensó 30 ml en cada frasco y se autoclavó a 121ºC, 15 lbs de presión por 20 min.

Desinfección de los Explantes

Se corto las hojas de la planta con peciolo de violeta africana (Saintpauliaionantha) y se lavó en agua corriente para eliminar impurezas y tierra.
Se sumergió los explantes en 500 ml de una solución al 1% de detergente comercial por 15 minutos y se agitó con la ayuda de una varilla de vidrio. Luego se enjuagó las muestras dos veces con agua destilada, y por último una vez con agua estéril. Posteriormente, se sumergió los explantes en 500 mL de una solución de fungicida por 15 minutos en agitación después se procedió a realizar el lavado con agua estéril dos veces y por último se sumergió los explantes en una solución de 500ml de cloro al 1% mas 3 gotas de Tween 20 durante 15min en agitación.

Siembra del Material Vegetal

Para la siembra se trabajó con todas las medidas asépticas necesarias. Después de la desinfección adecuada de la sala de siembra, camara de flujo laminar y el material de siembra. Se enjuagó las muestras tres veces con agua estéril, dentro de la camara de flujo laminar, se extrajo los explantes del agua estéril. Se realizó los cortes del tejido en pequeños cuadrados (5 mm de lado aprox.) y se colocó cuatro explantes por medio, sembrados dos poniendo por detras el envés y dos poniendo por delante el haz dela hoja de violeta (Saintpaulia ionantha).

Se incubó a: una temperatura de de 23ºC, humedad relativa 73%. Se evaluó los resultados dos semanas después.

RESULTADOS

Como se puede observar en la figura#1 y el figura#2 ninguno de los dos frascos presenta ningún tipo de contaminación ya sea esta por hongos o de bacterias en los dos casos existe curvatura y engrosamiento de los explantes lo que es signo de que se encuentra en crecimiento, es decir, existe una organogénesis directa en curso, como se puede visualizar el desarrollo es mayor en aquellos explantes a los cuales se los sembró con el envés hacia arriba.

FIGURA#1

FIGURA#2

En este caso de igual manera no existe ningún tipo de contaminación, y exite mayor engrosamiento y curvatura en aquellos caso en los que el explante se sembró con el envés hacia arriba como se puede corroborar en la figura#3.

FIGURA #3

FIGURA#4

FIGURA#5

Como se puede apreciar tanto en la figura#4 y 5 no existe ningún tipo de contaminación la peculiaridad es el tamaño de estos explantes puesto que este es mayor que los analizados anteriormente y se puede observar como la curvatura de estos y engrosamiento es mas pronunciado in dependientemente del lado que estos hayan sido sembrados.

FIGURA#6

Es el único frasco que presentó contaminación por hongos, ademas oxidación de los explantes, por lo cual no se puedeobservar ningún tipo de desarrollo en los mismos, como se puede visualizar en la figura#6.

FIGURA #7

FIGURA #8

En el caso de la figura #7 y 8 se puede observar que no existe ningún tipo de contaminación, aquí todos los explantes fueron sembrados con el envés hacia abajo no en todos existe una curvatura pronunciada pero si un engrosamiento considerable.

FIGURA#9

En este frasco no existe ningún tipo de contaminación de los explantes, se encuentran en menor número puesto que estos fueron cambiados a este nuevo medio porque en el frasco que estaban anteriormente existía indicios de contaminación y se los recuperó, existe un leve engrosamiento como se puede observa r en la figura#9

DISCUSIÓN

Es bastante común el uso de hojas de violeta africana para la organogénesis directa, y son varios los experimentos que se han realizado con la misma para la propagación masiva in vitro, con el fin de obtener brotes y posteriormente enraizarlos para una rapida clonación. (López y Peran, 2000)

Entonces como se dijo anteriormente el objetivo de esta practica es obtener brotes a partir de explantes de violeta africana sin embargo el factor tiempo fue el limitante para cumplir con dicho objetivo.

Según Pacheco (2001) afirma que se espera que para el 7mo día después de la siembra, se encuentre un inicio claro de respuesta, dandose un aumento en la densidad, longitud ygrosor de los tricomas del haz de las hojas, así como un plegamiento parcial de las hojas sobre sí mismas, se empiezan a notar algunas pequeñas protuberancias tempranas, nuestro resultados fueron tomados a las dos semanas es decir a los quince días de haber sembrado los explantes con lo que se puede evidenciar que la respuesta no fue tan inmediata, ya que según el mismo autor Pacheco (2001) señala que se al 10mo día, todos los explantes presentan una respuesta, se observa un gran número de domos y algunos indicios de iniciación de organogénesis. Para el 13vo día los domos anteriores, se observan con indicios de polaridad y formación de la sección meristematica de las plantulas. En el día 21, se presentan muchas plantulas con sus cotiledones bien formados y varias plantulas en estado juvenil.

Adicionalmente podemos recalcar que uno de los frascos presentaban contaminación por hongos un factor que limitó el desarrollo de los explantes razón por la cual estos no presentaron ningún tipo de respuestas.
Según Ohki (1994) la selección del haz o envés es un factor de suma importancia, en la mayoría de los explantes se pudo observar que aquellos que se encontraban sembrados con el envés hacia arriba existía una mejor respuesta tanto en engrosamiento como en curvatura-

Según Alvarenga y Abdelnour (1999) afirman que el proceso de organogénesis se lleva a cabo por ladesdiferenciación y rediferenciación celular inducida en los tricomas del lado adaxial (es decir el haz) de las hojas que son sembradas en el medio de cultivo. Esto es debido a que, en comparación con el lado abaxial (es decir el envés) y por medio de la observación al estereoscopio, se ha logrado en varias investigaciones visualizar una mayor cantidad de estos, lo que favorece directamente en el número de plantulas obtenidas.

Según lo que se menciona en Pachecho (2001) el aumento en la densidad o número de tricomas en la superficie adaxial del explante, así como también, una elongación y engrosamiento de los mismos; se debe al proceso de desdiferenciación y rediferenciación, celular de los tricomas, es decir nuestros explantes se encontraban en esta fase de la organogénesis directa, ayudados por los reguladores de crecimiento, a los que se encontraban expuestos como lo eran la kinetina (3 mg L-1) ANA (0,5 mg L-1)y tiamina (0,8 mg L-1) ,las auxinas provocaron la elongación y aumento de grosor, las citocininas el aumento en la densidad y la combinación de ambos inducen la formación de las plantulas.

CONCLUSIONES

De acuerdo con bibliografía se espera que los explantes en los que el haz se encontraba en contacto con el medio tengan los mejores resultados lo que lo pudimos comprobar ya que la mayor densidad de tricomas aumenta también las probabilidades de producir un mayornúmero de brotes.
El protocolo de desinfección fue un éxito, el uso de un fungicida adicional contribuyo muchísimo en que no exista contaminación fúngica a excepción de un caso que se puede asumir que fue falla de siembra mas no de protocolo de desinfección.
La cantidad de reguladores se puede decir que fue la exacta debido a que obtuvimos una respuesta, claro que esta no fue con la misma velocidad que la citada en bibliografía, por lo cual se podría realizar un ajuste de condiciones ambientales u otro factores
RECOMENDACIONES
Según menciona Steyer (1983) el estado fisiológico de la planta de la cual se extrae el explante es muy importante para el éxito de la propagación, se recomienda utilizar plantas sanas, jóvenes y especialmente libres de enfermedades, ya que basandonos en esto se puede calcular la concentración hormonal que debe ir en el medio de cultivo.

BIBLIOGRAFIA

* Alvarenga, S. y Abdernour, A. 1999. Micropropagación y organogénesis in vitro de Gloxinia spp. Centro de Investigación en Biotecnología (CIB), Instituto Tecnológico de Costa Rica. Cartago, Costa Rica. 19 p. https://bibliodigital.itcr.ac.cr:8080/dspace/bitstream/2238/45/1/BJFIB200343.pdf.
* Dolce N., Scocchi A., Mroginski E., Mroginski L. 2004. Organogénesis directa a partir de segmentos de hojas cotiledonares de Citrus sinensis (L.) Osb. Laboratorio de Cultivo.
* García, E. yMenéndez, A. 1987. Embriogénesis somatica a partir de explantes de cafeto. En: https://www.café-cacao.es
* Griffith, L 1998. Tropical Foliage Plants: a grower guide. Ball Publishing, Batavia, Estados unidos. 318p.
* López, C. y Peran, R. 2000. Embriogénesis Somatica. En: https://www.ciencias.upma.es/.
* Okhi, S. 1994. Scanning electron microscopy of shoot differentiation in vitro from leaf explants of the Africans violet. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 36: 157-162. https://bibliodigital.itcr.ac.cr:8080/dspace/bitstream. pdf.
* Pacheco, R. 2001. Evaluación del efecto de la luz sobre la propagación masiva de Sinningia speciosa vía organogénesis. Instituto Tecnológico De Costa Rica. Escuela De Biología. https://bibliodigital.itcr.ac.cr:8080/dspace/bitstream/2238/45/1/BJFIB200343.pdf.
* Revista ornamental. 2009. Saintpaulia ionantha (Violeta africana). www.arbolesornamentales.es/cultivo%20de%20Saintpaulia.pdf
* Roca, W. Mroginski, L. 1993, Establecimiento de cultivo de tejidos vegetales in vitro (eds) Cultivo de tejidos en la agricultura fundamentos y aplicaciones: 103. Cali, Colombia. CIAT.
* Xico Xicay C. 2008. Evaluación de materiales de cobertura y medios de cultivo alternativos para la reproducción in vitro de violeta africana (Saintpaulia ionantha) (en línea) disponible en: https://zamo-oti-02.zamorano.edu/tesis_infolib/2008/T2694.pdf.