CULTIVO DE MICROALGAS

I. INTRODUCCION

El cultivo de peces, crustaceos y bivalvos en general, de interés comercial requiere de la disposición de cantidades adecuadas de alimento de alta calidad en cualquier momento para mantenerlos saludables. La alimentación de estos organismos se realiza fundamentalmente con fitoplancton vivo por ser la mejor fuente nutricional.

En los últimos años se han hecho intentos de elaboración de dietas artificiales, tanto de origen fitoplanctónico, como harinas y levaduras. Estas dietas han tenido solo un éxito parcial en el remplazo de microalgas vivas y sus resultados hasta la fecha no han sido del todo satisfactorios porque presentan diversos problemas.

A pesar de su diminuto tamaño, aspiran a ser una gran revolución. Las microalgas podrían ser la base de combustibles ecológicos, de alimentos que ayudarían a cuidar la dieta y luchar contra el cancer, o de sistemas que absorberían el dióxido de carbono (CO2) y mitigarían el cambio climatico. Diversos investigadores y empresas trabajan para su desarrollo comercial a gran escala, pero reconocen que necesitan mejorar para lograr que estos productos lleguen a los consumidores.

Y para mejorar los productos se opto por el cultivo de las microalgas, un boom en todo el mundo, que permite no solo satisfacer la cantidad de los productos si no también la calidad de los pedidos.

Otras fuentes por las que se cultive las microalgas es porque tiene gran importancia en la cadena trófica, es decir sirve de alimento para otros animales propios del zooplancton, también de gran importancia alimenticia e industrial; como larvas de artemia,daphnia, y rotíferos; los cuales a su vez serviran de alimento a otros crustaceos y posteriormente a peces.


II. FUNDAMENTO TEORICO

Las microalgas son organismos unicelulares eucariotas fotosintéticos capaces de transformar la energía luminosa en energía química con una eficiencia cuatro veces superior a la de las plantas. Su importancia radica en su papel como productores primarios de la cadena trófica, que las constituyen en las primeras formadoras de materia organica.

Por su tamaño reducido y variado (5–50 µm en promedio) son de facil captura y digestión por multitud de organismos que se alimentan en forma directa del fitoplancton (Abalde, 2004).

Las condiciones óptimas de temperatura, intensidad luminosa, salinidad, nutrientes y pH para el cultivo de microalgas, varían ampliamente de una especie a otra, estos parametros fisicoquímicos, han sido determinados en laboratorio y nos ayudan a comprender las condiciones óptimas para el desarrollo de las diferentes especies en cultivo.

Actualmente a nivel comercial, los cultivos masivos de microalgas al exterior y los fotobiorreactores cobran mayor importancia para la producción de compuestos químicos de alta pureza, como: biocombustibles, biofertilizantes, intercambiadores iónicos y carotenos; así mismo, para el tratamiento de aguas residuales, obtención de compuestos terapéuticos y como alimento de consumo humano y animal (Contreras-Flores y col., 2003).

En condiciones normales todas las clases de microalgas poseen invariablemente la clorofila-a que confiere el color verde a las algas y al menos un pigmento accesorio, que puede enmascarar enocasiones a la clorofila-a. La clorofila-b se encuentra en las plantas verdes, la clorofila c en diatomeas, dinoflagelados y algas pardas y la clorofila d en las algas rojas.

Cultivadas bajo condiciones adecuadas de iluminación, temperatura, salinidad y concentración de nutrientes, las microalgas representan una excelente fuente de pigmentos carotenoides. Diversos estudios han demostrado que la producción de carotenoides en microalgas, como Dunaliella salina, puede optimizarse mediante variaciones en las condiciones de cultivo tales como: altas salinidades; incremento en la irradiación y en la temperatura (Ben-Amotz, 1987); ó estrés por limitación de nutrientes (Borowitzka y Borowitzka, 1988).

Las microalgas como organismos autótrofos fotosintetisadores, dependen de la luz para su desarrollo y producción de materia organica. La respuesta fotosintética a la energía luminosa se caracteriza por una respuesta lineal baja al incremento en la irradiancia, hasta llegar a su maxima capacidad fotosintética, donde las células son independientes de la irradiación (Abalde, 2004). Bajo condiciones estables (no movimiento) las células se aclimatan a un nivel de irradiancia, obteniendo bajo esas condiciones tasas de crecimiento y fotosintéticas no necesariamente óptimas mediante un ajuste en sus procesos fisiológicos.

En células aclimatadas a bajas irradiancias, la concentración de clorofila se incrementa para poder obtener la energía luminosa necesaria para continuar con el proceso fotosintético. Por otro lado, células aclimatadas a altas irradiancia, decrece la concentración celular de clorofila-a e incrementan la concentraciónde pigmentos accesorios fotoprotectores (carotenos) para evitar la oxidación de los fotosistemas. MacIntyre y col., (2002), reportan que células aclimatadas a alta iluminación no mostraron una tasa de crecimiento mayor que células en baja iluminación, porque a saturación de luz, las concentraciones de clorofilas seran proporcionalmente mucho menores de la masa total de los pigmentos celulares en alta iluminación.

A medida que va avanzando la ciencia se van descubriendo nuevas cosas, lo cual conlleva a conocer los diversos usos que podemos darle a las microalgas. En los últimos años, las nuevas oportunidades económicas y medioambientales y los avances en ingeniería genética han reactivado las investigaciones sobre ellas.

Se ha observado que la salinidad alta tiene influencia en la capacidad de la microalgas para adquirir los nutrientes necesarios para su crecimiento y productividad. Algunos autores han documentado una disminución en las densidades celulares finales cuando se aumenta la salinidad del medio de cultivo (Serpa-Ibañez, 2006; Barbarena y Montoya, 1990; Ben Amotz y Avron, 1989; Borowitzka y Borowitzka 1988; y Cifuentes y col., 1992). Estas condiciones no favorecen la producción de clorofilas, y si la de pigmentos accesorios, ya que a limitación de nutrientes (nitrógeno) las clorofilas son precursoras de otros pigmentos, razón por la cual puede haber una producción de carotenos celulares bajo estas condiciones (Cullen y Eppley, 1981).

Entre los compuestos de mas interés obtenidos de las microalgas, destacan los carotenoides, biodiesel, ficobiliproteínas, lípidos, polisacaridos, y compuestos conactividad biológica provenientes de las especies mas utilizadas tales como Dunaliella, Spirullina y Porphyridium. (Abalde y col., 1995) ademas de Chlorella, y Hematococcus. Se han identificado mas de 600 carotenoides producidos naturalmente en plantas, animales y hongos, de los cuales 400 han sido aislados y caracterizados; de éstos sólo un número reducido de 3 utiliza comercialmente destacando entre ellos el β-caroteno y la astaxantina y solo 50 poseen actividad provitamina A. Los carotenoides hidrocarbonados se denominan colectivamente como carotenos y aquellos que contienen oxígeno se denominan xantofilas (Ong & Choo, 1997; Rodríguez-Amaya, 1999; Che Man y Tan, 2003).

La mayoría de los carotenoides se obtienen mediante síntesis química. Solo dos microalgas unicelulares clorofíceas son fuentes comerciales reconocidas de carotenoides: la microalgas flagelada Dunaliella salina, que acumula β-caroteno y el alga verde de agua dulce Haematococcus pluvialis que produce astaxantina. Existen ademas otras especies de microalgas y cianobacterias cultivadas comercialmente como son: Chlorella, Spirullina, Dunaliella, Nannochloris, Nitzschia, Crypthecodinium, Schizochytrium, Skeletonema, Isochrysis y Chaetoceros (Sanchez-Varo, 2000).


Reproducción

En muchas ocasiones la reproducción de las algas ocurre sin ningún cambio en su ploidía, es decir son asexuales. Los mecanismos asexuales incluyen fisión, esporulación y liberación de fragmentos nucleados en formas multicelulares. La fisión es comúnmente binaria y ocurre dentro de la pared celular parenteral, sí esta se encuentra presente. En otros tipos, la pared original esdescartada y cada uno de los progenitores construye una pared antes o después de liberarse de la pared de la célula madre.

En otros tipos, especialmente en ciertas diatomeas y ciertos dinoflagelados, la pared original es repartida por el progenitor y cada nuevo individuo construye la porción fallante. Los procesos sexuales no han sido reportados para algas procarióticas (Cyanofíceas) contrariamente a lo ocurrido con las algas eucarióticas y Euglenoficeas, Crysoficeas o criptofíceas.



















Métodos de Cultivo.

Según su naturaleza.

Cultivos Intensivos

Son aquellos cultivos en que los factores de crecimiento se mantienen completamente bajo control, de modo tal que se obtiene una maxima respuesta en la producción de la población.

Cultivos Extensivos.

Son aquellos cultivos; en que sólo se controlan las variaciones mas asequibles en el manejo técnico, tales como las características químicas del medio y Ia densidad del cultivo.
Según la Forma de Cosecha.

Cultivos Continuos.

Se caracteriza porque una fracción del cultivo es removida regularmente y reemplazada por cultivo fresco. La desventaja de este método es la variabilidad en la cantidad de las células cosechada ya que algunas de ellas podrían ser senescentes y otras jóvenes. El suministro de nutrientes es constante.

Cultivo Batch

Se caracteriza por la intermitencia del cultivo. La carga de nutrientes y otros requerimientos se proporcionan al Inicio del cultivo solamente y se cosecha completamente, luego que la población ha alcanzado un nivel apropiado

3 Cultivos Semicontinuos.

Son principalmente unacombinación de los dos métodos anteriormente señalados.

Según su Pureza.

Cultivos Anexicos

Son cultivos en que la población se mantiene libre de bacterias. Se emplea comúnmente en cultivos continuos y semicontinuos. Es un tipo de cultivo delicado que requiere de un manejo cuidadoso.

Cultivos mono específico

Son cultivos en que la población de microalgas se encuentra parcialmente contaminada con otros organismos, tales como bacterias y protozoarios. Es empleado generalmente en cultivos de tipo Batch y extensivos
Los cultivos algales han sido utilizados en investigaciones genéticas, morfológicas, fisiológicas y bioquímicas, asimismo en una reevaluación de las limitaciones taxonómicas de muchas formas, polimorfismo, resistencia a antibióticos, variabilidad y mutaciones; han sido posibles mediante los cultivos algales. Por otro lado el desarrollo de cultivos sincronizados, en las que las diversas fases del crecimiento estan uniformizados, es importante para la comprensión de diversos fenómenos fisiológicos y bioquímico a nivel celular.

AISLAMIENTO DE LAS MICROALGAS

La aplicación de los siguientes métodos para una colecta natural de algas microscópicas producen cultivos monoespecíficos o axénicos (Trujillo, 1997).

Aunque tales métodos son sencillos, la preparación de cultivos axénicos requiere de paciencia y perseverancia.

En el aislamiento existen varías técnicas y modificaciones a éstas, pero en general se dividen en tres grandes categorías

Técnica de diluciones seriadas
Técnica de la micropipeta
Técnica de aislamiento en agar

1. Técnica de diluciones seriadas (Velasco. 19951): Esta técnica esselectiva y se emplea para obtener a las especies predominantes y/o mas competitivas de una muestra de agua, a su vez, por la misma razón Se eliminan facilmente las menos abundantes, que podrían ser consideradas de escaso interés debido a su crecimiento aparentemente inferior.

La técnica consiste en hacer diluciones progresivamente decrecientes de orden 1:10 a partir de la muestra original. Para este fin, se evalúa primeramente por cónico directo el número de ccl/ml de la muestra de agua, haciendo diluciones sucesivas hasta lograr concentraciones teóricas de fracciones de célula en la última dilución.

El procedimiento para diluir la muestra es el siguiente:

En el cuarto de inoculaciones se homogeniza la muestra de agua y de aquí se toma 1 ml para inocularlo en uno de los tubos que contiene 9 ml de medio, obteniendo así la dilución 1:10. Utilizar esta dilución y traspasar 1 ml a otro tubo para obtener la dilución 1:100. Repetir sucesivamente la misma técnica para obtener diluciones 1:1.000 y 1:10.000. Este último tubo subdividirlo en 10 tubos finales, inoculando 1 ml en cada tubo, en este caso se obtendrían 10 tubos con una dilución de orden 1:100000















2. Técnica de la micropipeta (Trujillo. 1997): El uso de la micropipeta permite ser selectivo en cuanto a que se aíslan las especies que uno mismo elige. Es la técnica mas directa para obtener una cepa monoespecífica. Es la técnica que se utiliza para obtener cultivos clónales, o sea cultivos iniciadores con una sola célula o entidad microalgal.

Cuando no se cuenta con pipetas capilares, una manera de preparar micropipetas es lasiguiente: se coloca en la flama de un mechero la parte final de la pipeta Pasteur y con la ayuda de una pinza, esta se alarga hasta obtener una tina pipeta capilar.

Una vez obtenido un número suficiente de micropipetas, se coloca sobre una porta objeto una gota de medio estéril a la cual se le agrega, con una micropipeta, una pequeña gota de la muestra de agua original. Es recomendable usar la micropipeta una sola vez para cada traspaso, esto es con el objeto de evitar cualquier tipo de contaminación.

Por observación al microscopio se localiza la zona con la menor cantidad de células y se aspira con la micropipeta una pequeña cantidad del líquido para traspasarlo a una nueva gota de medio estéril, 'lavando' de esta forma el cultivo y haciéndolo menos denso. Repetir esta misma operación hasta que en toda la gota se vea que existe solo una célula, aspirarla totalmente del portaobjeto y transferirla a un tubo de ensayo con 3 ml de medio de cultivo estéril y colocarlo en condiciones favorables para el cultivo.

La probabilidad de sobrevivencia de esta célula es muy baja, porque las células con pared celular muy fragil pueden dañarse al ser lavadas repetidamente, ademas de que la célula puede quedar dentro de la micropipeta y no ser inoculada dentro del tubo, de modo que se recomienda romper cuidadosamente la punta de la micropipeta e inocularla también dentro del mismo tubo fig. # 6





Figura #6.- Aislamiento de nñcroalgas (técnica de ta micropipeta). a:port aobjetos; b; objetivo; c: cultiva; d: medio fresco y estéril; e: micropipeta; f: microalga aislada en medio fresco y estéril..


3. Técnica del agar(Trujillo, I997): Algunas micro algas se aíslan mas facilmente de otros contaminantes en agar, ya que sólo se promueve el crecimiento de las especies que son capaces de crecer en este tipo de medios. Al utilizar modificaciones con esta técnica (rayado o rociado), se podran obtener cultivos monoespecífícos sobre todo en las partes finales (rayado) o en las zonas donde las gotitas de agua sean mas pequeñas y se encuentren mas dispersas (rociado).
El agar debe dispersarse uniformemente sobre la superficie del agua y dejarse embeber unos minutos para facilitar que entre en solución. Se recomienda usar agar al 2% (20 g de agar por cada litro de agua de mar).

Se esteriliza en autoclave, se retira y se deja enfriar hasta aproximadamente 50°C. Dentro del cuarto de inoculación, se mezcla perfectamente antes de vertirlo en el caso de placa debe cubrir aproximadamente 2/3 del alto de éstas. Cerrar parcialmente las cajas para dejar salir el exceso de vapor de agua. Tapar las cajas una vez que el agar solidifique a temperatura ambiente. Estas deben conservarse invertidas en refrigeración.

En el caso de tubos traspasar 10 ó 20 ml de la solución de agar ya mezclada (según la capacidad del tubo), para esterilizarlos dejar la rosca sin ajustar por lo menos media vuelta para permitir un adecuado ajuste de presiones en la autoclave. Cerrar herméticamente las roscas después de la esterilización. Colocar los tubos sobre una superficie inclinada y permitir que solidifique el agar en esa posición. Mantener posteriormente los tubos en refrigeración.

4. Rayado paralelo en placas de agar (Trujillo, 1997): Esta técnica se usa cuando la muestra deagua contiene gran variedad de especies. Esterilizar el asa al rojo y esperar a que enfrié. Homogenizar la muestra de agua original y tomar una asada. Levantar parcialmente la tapa de la caja Petri y empezar por descargar el asa en uno de sus extremos para hacer rayados paralelos sobre la superficie del agar, diluyendo de esta forma la muestra. Los puntos rojos son los lugares de donde se toma muestra para hacer los siguientes rayados. Cubrir, invertir, e inocular las cajas en condiciones favorables para su crecimiento.







5. Rayado en zig-zag (Trujillo. 1997): Puede usarse esta técnica cuando la muestra de agua cuente con pocas especies mezcladas. Esterilizar el asa al rojo y homogenizar la muestra. Levantar parcialmente la tapa de la caja Petri, los puntos rojos y amarillos en la placa indica el lugar en donde se descarga el asa ce inicia la serie de zig-zag por toda la superficie del agar. Las cajas se cubren, invierten e incuban en condiciones favorables para su cultivo.
















6. Rayado en agar inclinado (Trujillo, 1997): En la practica se ha visto que, a diferencia de una caja Petri, el uso de agares en tubo garantiza trabajar en condiciones asépticas. Esto es debido a que existe un mayor control sobre un cultivo inoculado en un tubo con tapa rosca, puesto que este puede mantenerse totalmente cerrado, evitando de esta forma tanto el paso de otros contaminantes, de que el agar se reseque a medida que pasa el tiempo. Esterilizar el asa y homogeneizar la muestra de agua. Descargar el asa en el fondo del tubo donde inicua la superficie del agar y trazar un zig-zag a todo lo largo dela superficie como se muestra en la figura. Flamear la boquilla del tubo antes de cernirlo. Los tubos se colocan en una gradilla e incuban en condiciones favorables para su cultivo.












CRECIMIENTO DE LAS ALGAS

Fases de Crecimiento

Son cinco las fases de crecimiento en un cultivo típico de microaIgas. En las que se definen por el número de células presentes a un tiempo (edad) determinado y por las condiciones generales del cultivo (HofT & Snell. 1989 en: Uribe. 1994).

a) Fase de latencia o fase inicial En esta fase es poco et incremento o densidad celular, es una fase de adaptación de las células a las nuevas condiciones de medio. Muchas enzima melabólicas llegan ser inactivas y las concentraciones de materiales celulares caen a niveles que afectan la división de la célula, antes de reanudar el crecimiento a las algas les toma un corto período de tiempo aclimatarse a su medio acuatico. Otro factor que contribuye a La fase inicial, es el requerimiento de alcanzar los niveles maximos de compuestos específicos antes de que la fase exponencial comience. Altas concentraciones de calcio, magnesio o fósforo pueden extender la fase de laten cía. Esta fase se puede dilatar entre I a 3 días, dependiendo del tamaño y del estado del inoculo.

b) Fase exponencial o desarrollo logarítmico En esta fase la división celular se incremente en función del tiempo. El incremento de la población existente es debido a que las células estan asimilando los nutrientes en el medio y su proceso de reproducción asexual es activo. La fase exponencial puede presentarse del segundo al tercer día después deinoculado el medio y prolongarse hasta 4 días. Si se controla la dilución del cultivo ésta etapa puede prolongarse por semanas.

















c) Fase de declinación de la fase exponencial La división celular es lenta cuando los nutrientes han sido consumidos y su carencia limita el crecimiento. Puede durar de uno a dos días en que la edad del cultivo alcanza su valor maximo.
d) Fase estacionaría En esta fase el factor limitante (carencia de nutrientes) y tasa de crecimiento esta balanceados, es decir que las densidades celulares se mantienen relativamente constantes por un período relativamente prolongados. Esta fase es muy corta en grupos de cultivos donde los nutrientes son consumidos y no reemplazados.

f) fase de declinación o muerte.- Durante esta fase las células sufren la completa limitación por escasez de nutrientes, la densidad celular comienza a fenecer rapidamente liberando azucares, proteínas, lípidos los cuales son aprovechados en algunos casos por bacterias oportunistas que se alimentan de ella desplazando a la población que aun se mantiene viva pero que rapidamente colapsa

III OBJETIVOS:
Conocer la técnica de cultivo de algas
Reconocer los diversos colores y tamaños de las microalgas con ayuda del microscopio óptico.
Aprender a contar micro algas mediante la utilizacion de la camara de Neubauer

IV.EQUIPOS Y MATERIALES:
Agua de mar
Recipiente transparente (botellas plasticas de 1.5 y de 3 litros de capacidad, sin ranuras)
Pipetas estériles
Gaza
Algodón
Soluciones (nitratos, sulfatos, silicatos, vitaminas)
Paliglotos
Aireador
Fluorescente
Cepas de microalgas