Hidatidosis humana en el Perú es basicamente restringido a Echinococcus granulosus genotipo
Saúl J. Santivañez †, Ariana M. Gutierrez †, Mara C. Rosenzvit, Patricia M. Muzulin, Mary L. Rodríguez, Julio C. Vasquez, Silvia Rodríguez, Armando E. Gonzalez, Robert H. Gilman, Hector H. García *, y el Grupo de Trabajo Cisticercosis en Perú
Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias, Universidad Peruana Cayetano Heredia, Lima, Perú, Departamento de Parasitología, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas 'Dr. Anlis Carlos G. Malbran ', Buenos Aires, Argentina; Unidad Cisticercosis, Instituto Nacional de Ciencias Neurológicas, Lima, Perú, Programa de Cirugía Toracica y Cardiovascular, Hospital Nacional Dos de Mayo, Lima, Perú, la Escuela de Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Perú, el Departamento de Salud Internacional, Escuela Bloomberg de Salud Pública de Johns Hopkins Universidad, Baltimore, Maryland

Abstracto
Un estudio molecular de PCR usando ADN de 21 quistes hidatídicos se realizó para determinar qué tipo cepa es el responsable de la infección humana en el Perú. El mitocondrial citocromo c oxidasa subunidad 1 (CO1) gen se amplificó en 20 de 21 muestras, revelando que todos menos 1 muestra (19/20, 95%) pertenecía a la cepa de oveja común (G1). Las muestras restantes pertenecían a la cepa de camello (G6). El genotipo G1 se encontró con mayor frecuencia en los casos humanos de hidatidosis quística (CHD) en Perú. Medidas de control locales deben centrarse principalmente en la disminución de la infección de perros y ovejas en lugar de depósitos intermedios.INTRODUCCIÓN
Todas las 5 especies reconocidas dentro del género Echinococcus requieren 2 huéspedes para perpetuar su ciclo de vida: un carnívoro como el huésped definitivo, que lleva el adulto productor de huevos del gusano de la cinta, y un herbívoro como el huésped intermedio en el que establece las etapas de larva y desarrollar metacestodo, causando la hidatidosis. Echinococcus granulosus causa la hidatidosis quística (CHD), Echinococcus multilocularis provoca la hidatidosis alveolar, Echinococcus oligarthus y Echinococcus vogeli causan hidatidosis poliquística, y Echinococcus shiquicus causa (unicelulares) miniquistes hidatídicos enfermedad.1-3 Los humanos pueden actuar como huéspedes intermediarios de las primeras 4 especies, con diversas manifestaciones clínicas dependiendo del órgano afectado y tipo de larvas.







Hidatidosis quística es una zoonosis importante y generalizada, especialmente en ganado de ovejas en areas de Europa (países mediterraneos), Asia (Rusia, China), el norte y el este de Africa, Australia y América del Sur (Perú, Bolivia, Argentina, Chile, Uruguay y Río Grande do Sul en Brasil). Afecta el hígado (52-77% de los casos), pulmón (9-44%), y otros órganos tales como el cerebro, el corazón y huesos.4-6 CHD es un importante problema de salud pública en el Perú, con una prevalencia del 6-9% en muchas zonas del país y numerosos casos humanos reportados cada año.6, 7
Alrededor del mundo, las encuestas de caracterización de las cepas han demostrado que la infección humana es principalmente por la cepa de oveja común (G1) en el continente Australia, Tasmania, Jordania, Líbano, Holanda, Kenya,China y España.8-11 G1 pueden coexistir con otras cepas, como la cepa de ganado (G5) en Holanda, camello cepa (G6) en Nepal, Iran y Mauritania; cerdo cepa (G7) en Polonia y Eslovaquia, y la cérvido(ciervo) cepa (G8) en los Estados Unidos. Cuando múltiples cepas estan presentes, se puede infectar a huéspedes intermediarios atípicos, por ejemplo, infección G5 en ovejas y cabras en Nepal y G7 infección castor en Polonia.10, 12 En Argentina, las infecciones humanas son causadas por cepas G1, G2, G5 y G6.13-16 Hay poca información disponible sobre la composición de la cepa de la hidatidosis en otros países latinoamericanos países.17,18 Se llevó a cabo una encuesta mediante un analisis y Secuenciación en PCR de CO1 de E. granulosus los aislamientos de los seres humanos para determinar las cepas de E. granulosus que infectan a los seres humanos en el Perú.
MATERIALES Y MÉTODOS
Este estudio se realizó en Lima, Perú, en el Hospital Nacional Dos de Mayo (un gobierno centro de referencia para el tratamiento de la enfermedad hidatídica), utilizando el material de quistes extirpados de pacientes sometidos a una cirugía de cardiopatía coronaria durante el periodo marzo 2006 hasta enero 2007. Inmediatamente después de la escisión, el espécimen se colocó en etanol (70%), se almacena a 4 ° C, y se procesa dentro de 2 días de colección.
Información macroscópica en el aspecto, el tamaño y el estado de las larvas fue recogido de informes quirúrgicos. La naturaleza y la fertilidad de la muestra fueron confirmados por observación microscópica de E. granulosus protoescólices. Cada quiste se separó en membrana y fluido intraquística conprotoescólices (arena hidatídica). La capa germinal se lavó 3 veces en etanol para eliminar cualquier contaminante (escombros, sangre, tejido huésped), y tanto en la membrana y arena hidatídico fueron preservados sumergido en etanol al 70% y se almacenó a -20 ° C. Las muestras fueron enviadas a Departamento de Parasitología, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas, ANLIS, en Buenos Aires, Argentina, para la identificación de la cepa. Allí, el total de E. granulosus ADN se extrajo utilizando el kit DNeasy Tissue (QIAGEN, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras Purificadas de ADN se almacenaron a -20 ° C hasta su uso en la reacción PCR. genotipo de E. granulosus se determinó mediante la citocromo c oxidasa subunidad mitocondrial 1 (CO1) secuenciación, como anteriormente describe.15 Las secuencias se determinaron en el Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA, en Buenos Aires (USFCEyN).
Reacciones de PCR adicionales realizadas fueron amplificación del fragmento mitocondrial DCO1 usando el conjunto de cebadores DCO1F DCO1R y como se ha descrito previamente por Cabrera y otros19, la amplificación del gen de la actina E. granulosus según lo descrito por da Silva y others20, y la amplificación de un elemento de ADN repetitivo E. granulosus como se describe por Abbasi y otros.21
RESULTADOS
Se analizaron un total de 21 quistes de 21 personas. La mayoría de los individuos (N = 18) fue de los pueblos de las tierras altas del Perú central, con altitudes que varían entre 3000 y 4500 m sobre el nivel del mar. Pueblos de la zona tienen ecología similar, la agricultura y laganadería. De los 21 quistes, 19 fueron quistes pulmonares y 2 eran quistes hepaticos. 7 quistes mostraron evidencias complicaciones (2 infectado y 5 ruptura), y 4 quistes tenían quistes hijos (subquistes). El volumen medio fue 586,68 ± 627,46 ml (rango 8-2250 ml) (Tabla 1). Se observaron protoescólices Conservas bajo el microscopio en 8 quistes. En los otros 13, las células del parasito, degenerado protoescólices y / o un parasito estructuras-por ejemplo, ganchos, se observaron. El gen CO1 se amplificó en 20 de 21 muestras (Figura 1).
Una segunda reacción de PCR-CO1 con adición de un ADN de control de E. granulosus interna era llevado a cabo en la muestra nonamplifying. Debido a que una banda de control del tamaño esperado era obtiene, descartamos la presencia de inhibidores en la muestra. Ademas, una segunda reacción a amplificar una región mas interna de la citocromo oxidasa subunidad gen c 1 se llevó a cabo por DCO1 utilizando cebadores para determinar si la ausencia de la amplificación fue producida por sustituciones en el CO1 recocido sitio de cebadores. Una vez mas, no se obtuvieron productos de amplificación. Para confirmar la identidad y la calidad del ADN extraído a partir de esta muestra, usando 2 reacciones diferentes Se realizaron cebadores (1 para el gen de actina constitutiva y 1 para una granulosus-específica E. elemento de ADN repetitivo). En ambos casos, se obtuvo el producto de amplificación esperado (Figura 2). Detalles sobre estas reacciones se proporcionan en el material en línea suplementario a las www.ajtmh.org.
La secuenciación del gen mitocondrial CO1 confirmó que todos los 20 quistes, cuyomaterial fuefueron amplificados de E. granulosus metacéstodos. Todos menos 1 muestra (19, 95%) pertenecían a la cepa oveja común (G1). La muestra restante pertenecía a la cepa camello (G6) (Tabla 1).





DISCUSIÓN
Con la secuenciación del gen mitocondrial CO1, hemos demostrado un claro predominio de la cepa oveja / perro común (G1), con un solo aislado de camello / perro de tensión (G6) de E. granulosus en casos humanos CHD peruanos. No fue posible identificar la razón por la 1 de la muestra hizo no amplificar a pesar de ser confirmada como ADN de E. granulosus por otros marcadores moleculares. Dado que la inhibición se demostró que era poco probable, una posible explicación sería la presencia de una mutación en el gen CO1.
Hasta la fecha, 10 distintas variantes intraespecíficas genéticos bien caracterizados son reconocidos dentro de E. granulosus (genotipos G1-10), basado en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificación por secuenciación marcadores mitocondriales en el citocromo c oxidasa 1 (CO1) y nicotinamida adenina dinucleótido deshidrogenasa 1 (ND1) los genes. Siete de ellos son infecciosos para humans22-25 (Tabla 2). No parece haber variación genética muy limitada dentro de E. multilocularis, y hay se dispone de datos para evaluar la variabilidad en la secuencia E. vogeli, E. oliganthus o E. shiquicus. Variantes intraespecíficas o 'cepas' pueden jugar un papel importante en relación no sólo a los patrones de ciclo de vida y los conjuntos de acogida, sino también a la dinamica de la transmisión, el control de la enfermedad, la patogenicidad, la fertilidad de los quistes desarrollados, y la tasa decrecimiento.1 ,13,16,23,26-31
Aunque el número de aislamientos peruanos examinados no era amplia, el genotipo G1 fue mucho mas frecuente en los seres humanos que el genotipo G6. La cepa ovejas común, G1, es ampliamente reportado como causa de infección humana en el sur y el este de Europa, Norte y Este Africa, partes de Asia, Australia y América del Sur (Argentina). Aunque predominantemente afecta a las ovejas, en algunos casos, la infección G1 de otros hospederos intermediarios, tales como vacas y cabras, ha sido described.13, 15,16,27 Por otro lado, G6, típicamente una cepa camello, también ha sido informó en cattle.32, 33 En Argentina, esta cepa puede contribuir para un maximo de 37% de las enfermedades del corazón humano casos, en segundo lugar a la infección G1 con 46% 0,13 Nuestras muestras analizadas provenían del Perú Tierras altas centrales, que constituyen aproximadamente el 70% de las areas endémicas para la enfermedad coronaria en el Perú. Aunque es posible que las muestras de la Sierra Sur (Puno, Cusco), cerca de Bolivia y Chile podría tener diferentes patrones, consideramos que es poco probable dadas las altas similitudes en términos de la ecología, la altitud, la conducta y el ganado en alto.
G1 es la cepa mas común en los casos de cardiopatía coronaria humanos en todo el mundo. Apoya su predominio que la endemicidad de E. granulosus en la sierra del Perú se basa en un ciclo de ovejas / perro. Este es muy coherente con su distribución geografica, la superposición de las principales zonas de cría de ovejas entre 3200 y 4500 metros de altitud. Esta información proporciona soporte para concentrarse lasmedidas de control en el Perú para reducir perro y las ovejas las tasas de infección en lugar de trabajo en otros depósitos intermedios.



Figura 1.
PCR de Amplificación mitocondrial citocromo c oxidasa subunidad 1 (CO1):
Calle 1, tamaño marcador ( ladder); calle 2, HP1; calle 3, HP2; calle 4, HP3; calle 5, HP4; calle 6, HP5; calle 7, HP6; calle 8, HP7, calle 9, HP8, calle 10, HP9, calle 11, control positivo, la calle 12, el control negativo.


Figura 2.
Esquema de CO1 y DCO1 primers adjunto sitio. Esta cifra aparece en color a www.ajtmh.org.


PCR nested o anidado
Primero amplificas con CO1 que da un amplicon de 440 pb con los primer de CO1, y ese amplicon resultante es amplificado por los primers DCO1 y obteniendo un amplicon de 285 pb. Obteniendo una región mas pequeña aumenta la sensibilidad de la técnica y la especificidad


Localización y características de los quistes hidatídicos relacionados con la cepa Echinococcus granulosus

HP Organ affected Geographic location Type Daughter cyst Volume (mL) Strain

1 Lung* (LLL) Pasco Hyaline No 810 G1
2 lung (LLL) Junin Hyaline No 441 G1
3 Lung (LLL) Ayacucho Broken Yes 2250 G1
4 Liver (RHL) Pasco Hyaline No 100 G1
5 Lung (RUL) Junin Hyaline No 384 G1
6 Lung (LLL) Huancavelica Broken No 90 G6
7 Liver (RHL) Junin Infected No 216 G1
8 Lung (RUL) Lima Broken No 96 G1
9 Lung* (LLL) Junin Hyaline No 595 G1
10 Lung (RUL) Ayacucho Hyaline No 576 G1
11 Lung* (LUL) Pasco Infected Yes 420 -
12 Lung (RLL) Pasco Hyaline No 2085 G1
13 Lung(LLL) Lima Hyaline No 125 G1
14 Lung (RUL) Pasco Hyaline Yes 448 G1
15 Lung (LLL) Huancavelica Hyaline No 1500 G1
16 Lung (RUL) Junin Broken No 770 G1
17 Lung (RLL) Junin Broken Yes 80 G1
18 Lung (RLL) Junin Hyaline No 576 G1
19 Lung (ML) Lima Hyaline No 8 G1
20 Lung (LUL) Junin Hyaline No 175 G1
21 Lung* (LLL) Ayacucho Hyaline No 576 G1


LLL = lóbulo inferior izquierdo; RHL = lóbulo hepatico derecho, RUL = lóbulo superior derecho; LUL = lóbulo superior izquierdo; RLL = lóbulo inferior derecho, '-' = tensión no se pudo determinar.
Características de los diferentes genotipos de Echinococcus granulosus

Genotipo (cepa)* huésped definitivo huésped intermediario infecta Humanos El período prepatente

G1 (common sheep strain) Dog, fox, dingo, Sheep, cattle, goat, Yes 45 days
wolf jackal, hyena buffalo, camel, pig, kangaroo.
G2 (Tasmanian sheep strain) Dog Sheep, cattle Yes 39 days
G3 (buffalo strain) Dog, fox? Buffalo, cattle ?
G4 (horse strain) Dog Horse, donkeys No More than G1
G5 (cattle strain) Dog Cattle, sheep, goat, buffalo Yes 33-35 days
G6 (camel strain) Dog Camel, goat, cattle, sheep Yes 40 days
G7 (pig strain) Dog (fox?) Pig, wild boar, beaver Yes 34 days
G8 (cervid strain) Wolf, dog Moose Yes ?
G9 ? Pig? Yes ?
G10 (Finland cervid strain Moose ? ?

Genotipo (cepa), determinado por técnicas moleculares, '?' Número indeterminado o bajo de la muestra analizada (véanse las referencias 1, 10, 16, 24, 26, y 34 a 39.).