INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA

LABORATORIO DE FISIOLOGÍA Y BIOQUÍMICA MICROBIANA

PRACTICA No. 2 “BALANCE DE FERMENTACION”


EQUIPO: 4 SECCIÓN: 1

| VALOR ASIGNADO | VALOR OBTENIDO |
HIPOTESIS | 3%
OBJETIVO | 1%
REGISTRO DE DATOS | 3%
MANEJO DE DATOS | 4%
DISCUSIÓN | 5%
CONCLUSIÓN | 3%
BIBLIOGRAFÍA | 1%
TOTAL | 20%

DISEÑO EXPERIMENTAL
Requerimos llevar a Saccharomyces cerevisiae a un ambiente carente de oxigeno para que lleve acabo la fermentación alcohólica, por medio de la Glucosa como sustrato y obtener etanol y bióxido de carbono, para que posteriormente estos sean cuantificables por distintos métodos. A partir de la mezcla de fermentación se podra cuantificar la glucosa residual por el método del DNS, etanol por el método de Conway, y finalmente cuantificaremos en CO2 por un método Gravimétrico. El método de Conway es utilizado ya que permite la oxidación del etanol a acido acético por la reacción efectuada con el dicromato de potasio.

Se llevara acabo la separación de compuestos volatiles por medio del método de Conway, que costa de una camara de 2 compartimentos, un externo (fuera) y el interno(centro) y se utilizara el reactivo indicado para la muestra1.

En el compartimento externo se coloca la muestra junto con el carbonato depotasio el cual funciona como agente liberador de los grupos -OH y en el compartimento interno se coloca el dicromato de potasio que atrapara a los –OH. El etanol al reaccionar con el dicromato de potasio es oxidado a acetaldehído y acido acético mientras que el ion crómico (Cr IV) que posee un color amarillo se reduce a crómico (CrIII) el cual tiene un color verde-azul. La intensidad del color es directamente proporcional a la concentración de etanol2.
Primera etapa: oxidación del etanol a etanol

Segunda etapa: oxidación del etanol a acido acético.

Determinación de CO2 por gravimetría
Después de la fermentación quedo una muestra en el vaso central, en esta muestra lo que paso fue que el dióxido de carbono liberado de la fermentación reacciona con el hidróxido de sodio formando bicarbonato de sodio el cual al estar en presencia de exceso de hidróxido de sodio, vuelve a reaccionar hasta formar carbonato de sodio.
CO2 + NaOH NaHCO3
NaHCO3 + NaOH Na2CO3 + H2O
Después la muestra se transfirió cuantitativamente sobre 20 ml de BaCl2 al 5% contenido en un matraz Erlenmeyer de 125 ml. Se hicieron 2 lavados, de dicho vaso central el cual contenía la muestra, con agua destilada libre de CO2 en este paso lo que ocurrió fue que el cloruro de bario reacciono con la muestra y se formo otra sal de carbonato de bario la cual precipito mejor debido al peso atómico del bario.
Na2CO3 + BaCl2 BaCO3 + 2NaCl
El precipitado deBaCO3 que quedo se recupero por filtración a través de papel filtro de Whatman No 1 de peso conocido. El papel con la muestra se deseca en una estufa a 60° C durante 20 y 24 horas y posteriormente haciendo uso del factor gravimétrico obtenemos la cantidad original de dióxido de carbono en milimoles.

Determinación de Glucosa residual por el método de DNS.

Para determinar la cantidad de glucosa residual se utilizo el método del 3 dinitrosalicílico (DNS), esto nos sirvió para calcular la cantidad de glucosa fermentada para posteriormente sacar los milimoles de glucosa este método se basa en la reducción del DNS (color amarillo) por la glucosa pasando a color rojo cuya presencia puede detectarse por lectura de la absorbancia a 540 nm.

HIPOTESIS
Si Saccharomyces cerevisiae lleva acabo el proceso de fermentación, entonces al ponerla en presencia de glucosa como fuente de carbono y en ausencia de oxigeno, la reducira dando como resultado la reducción simultanea de productos que es etanol y CO2.

Objetivo General

* Con los datos obtenidos experimentalmente, se realizara el balance de carbonos y el balance óxido-reducción. Discutira y evaluara el significado de dicho balance para la célula microbiana.

Objetivos Particulares
* Determinar cuantitativamente el etanol producido por el proceso de la fermentación llevada acabo por Saccharomyces cerevisiae .
* Determinar cuantitativamente la cantidad de glucosa fermentada por Saccharomyces cerevisiae .
*Cuantificar la cantidad de CO2 producido por la fermentación a partir de un método gravimétrico.
* Conocer la cantidad de productos oxidados y reducidos y el porcentaje de carbono recuperado por medio de un balance de fermentación.

REGISTRO DE DATOS.
Tabla 1. Datos obtenidos para la curva tipo del etanol |
μg de etanol | Absorbancia a 445 nm |
0 | 1.394 |
250 | 1.346 |
500 | 1.284 |
1000 | 1.143 |
1500 | 1.048 |
2000 | 0.842 |
2500 | 0.771 |

Tabla 2. Absorbancias obtenidas en la fermentación. |
Muestras | Absorbancia a 445 nm |
0.2 mL de muestra fermentada | 0.983 |
0.5 mL de muestra fermentada | 0.636 |
1.0 mL de muestra testigo | 1.274 |

Tabla 3. Datos obtenidos para la curva tipo de glucosa. |
μg de Glucosa | Absorbancia a 540 nm |
0 | 0 |
100 | 0.590 |
200 | 0.927 |
300 | 1.422 |
400 | 1.613 |
500 | 1.789 |
Tabla 4. Absorbancias obtenidas de la glucosa residual |
Muestras | Absorbancias a 540nm |
0.2 mL de sobrenadante diluido 1:10 | 0.340 |
0.5 mL de sobrenadante diluido 1:10 | 0.637 |
1.0 mL de sobrenadante testigo diluido 1:10 | 0.064 |
Tabla 5. Datos obtenidos para la cuantificación de CO2 |
Muestras | Peso en gramos (g) |
Papel filtro | 0.855 |
Papel filtro + BaCO3 | 0.955 |
BaCO3 de fermentación | 0.1 |
Papel filtro Testigo | 0.842 |
Papel filtro testigo + BaCO3 testigo | 0.901 |
BaCO3 Testigo | 0.059 |

MANEJO DE DATOS.
Glucosa inicial
Se utilizó 0.5mL de glucosa a 2M, por lo cual0.5*2M= 1mmol
Curva tipo de Glucosa

Grafico 1 curva tipo de glucosa por el método del DNS.
Glc. Interpolada
Y=0.0036 x + 0.1633 (ECUACIÓN DE LA RECTA)
Se despeja de la ecuación de la recta “x” para obtener la concentración
x=Absorbancia-0.16330.0036


x= 0.340 -0.1633 =49μg
0.0036

Las absorbancias obtenidas se tienen en µg así que para realizar los calculos se debe pasar a mg.
49μg = 0.049mg
Glc residual = (Glc interpolada) (1/alícuota) (FD)
En este caso la alícuota tomada fue:
* 0.2mL
* 0.5Ml
El factor de dilución fue 10
mg Glc/10ml = 0.049 mg x 5 x 10= 2.45 mg Glc/ml
Los resultados obtenidos de los dos problemas deben de ser similares, por lo cual se llevara a cabo un promedio
* Nota: Para el testigo se tomó una alícuota de 1mL y no se realizó dilución. Dado que este testigo carecia de glucosa se toma 0 de absorbancia.

Por cualquier interferencia que pueda haber en el método o material utilizado, se debe obtener la glucosa residual real con la fórmula
Glc residual real mg/mL=mg/mLde Glc residual del problema – mg/mL de Glc residual del testigo.
Glc residual real mg/mL= 2.45+0= 2.45 mg/mL
Glc fermentada = Glc inicial – Glc residual (real)
Glc fermentada =180-2.45=177.55

La glucosa fermentada debe pasarse a mmol para el balance de fermentación:

Pm Glc 180mg 1mmol
Glc fermentada x1

x1 glucosa fermentada en mmoles=0.986mmoles
ETANOL REDUCIDO
y= 1.4064 – 0.0003 xDe la ecuación de la recta se despeja “x” para determinar la concentración
x =y–1.4064 /- 0.0003

Grafico 2: curva tipo de etanol obtenido de fermentación alcohólica por el método de Conway.
Etanol interpolado
En “y” se sustituye las absorbancias obtenidas
x (p0.2)= 0.983 – 1.4064 = 1411.3µg= 1.411mg
-0.0003

x (t)= 1.121-1.40 = 441.3 µg= 0.441mg
-0.0003

Se deben de tener en cuenta la alícuota que se tomó en este caso fueron:
* 0.2
* 0.5

mg etanol= [etanol] x 1/ alícuota
Los miligramos se piden en 10 mL por lo cual se multiplica por 10:
mg etanol/10 ml= [etanol] x 1/ alícuota x 10
mg etanol/10mL(p0.2)= 1.411 x 5 x 10=70.55
mg etanol/10mL(t)= 0.441 x 1 x 10= 4.41
Por cualquier defecto que pueda tener el método o los instrumentos se debe sacar los mg de etanol reales.
mg/10mL de etanol real = mg/10mL de etanol del problema - mg/10mL de etanol del testigo.
mg/10mL de etanol real = 70.55 – 4.41 = 66.14mg/10mL

Pm del etanol 46 mg
Etanol producido

46 mg -------- 1 mmol
66.41 --------- x2

X2 = 1.437mmol

CO2 FORMADO

NaOH + CO2 -----------> Na2CO3 + H2O

Na2CO3 + CaCl2------->BaCO3 + NaCl (pp blanco) CUANTIFICAR

BaCO3 ( PM= 197.3 mg/mmol )
CO2 ( PM= 44 mg/mmol )

Peso de la muestra (BaCO3)
Problema= (Peso papel + muestra) – Papel
Testigo= (Peso papel + muestra)- Papel
P= 0.955-0.855 =0.1 g = 100 mg
T= 0.901 – 0.842= 0.059g = 59mg
BaCO3 Reales
mgBaCO3 (Reales)=mgBaCO3 P– mgBaCO3T
mgBaCO3 (Reales)= 100 – 54 = 41mg
CO2 Formado
mgCO2 formado = mgBaCO3 (reales) (PMCO2/PMBaCO3)
mgCO2 formado = 41 (44/197.34)= 9.14mg
CO2 Formado en mmol
44 mg -------- 1 mmol
9.14mg --------- x2

X2 = 0.207mmol

Balance de fermentación:

Ecuación de la fermentación alcohólica, donde por cada mol de glucosa se obtienen dos moles de etanol y dos de dióxido de carbono.

Tabla 6: datos para el balance de fermentación alcohólica:
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
Glucosa | 0.986mmol | 1 | 0 | ---- | --- | --- |
Etanol | 1.437 mmol | 1.457 | -2 | ---- | -2.914 | 2.914 |
CO2 | 0.207 mmol | 0.209 | +2 | 0.418 | --- | 0.209 |
=0.418 | =2.914 | =3.123 |
Acotaciones:
1 Glucosa utilizada y sus productos formados en mmoles.
2.-Cantidades de sustrato fermentadas y las de productos finales formados en mmoles de productos formados por 1mmol de sustrato (glucosa
3.-Estado de oxidación del sustrato y de los productos.
Productos oxidados
5.- Productos reducidos.

%C recuperado= ( productos / 6)*100= 3.1236*100=52.05%
I. O/R=productos oxidadosproductos reducidos =0.4182.914= 0.1434
Discusión:
En los datos obtenidos de la practica de balance de fermentación se observa:
En el caso de la glucosa se obtuvo que por 1mmol de glucosa se fermentaron 0.9854mmol, lo cual indica que practicamente casi toda la glucosa fue fermentada por la levadura.
Los mmoles de etanol obtenido fueron 1.63, aunque el rendimiento teórico esperado era de1.97 ya que por cada mmol de glucosa se obtienen 2 mmoles de etanol. Esto podría deberse a que no se agrego la cantidad suficiente de carbonato de potasio ya que este es el agente liberador de los grupo –OH o que no se agrego el suficiente dicromato de potasio ya que este reactivo atrapara los iones –OH para ser oxidado a acetaldehído y ac. Acético. También podría deberse a que al momento del procedimiento no se sello correctamente la camara ya que este método lleva a cabo la separación de 2 compuestos volatiles.
Los mmoles de dióxido de carbono obtenidos fueron 0.2081 y el teórico esperado era de 1.97. Se observa un rendimiento muy bajo, esto podría deberse a que el tamaño del vaso en el que se atraparía el CO2 que era de un area y volumen muy pequeño o a que no se agrego la cantidad adecuada de hidróxido de sodio ya que este es un método indirecto.
Otras razones por las que se obtuvo un rendimiento bajo es que pudo entra un poco de oxígeno al matraz y se generó el efecto Pasteur, llevando el metabolismo de la glucosa a una respiración aerobia2, evitando la producción de etanol, por ello los birreactores se cierran herméticamente.
Al observar el % de C recuperado se observa un porcentaje bajo, que es de 52% del rendimiento experimental varía entre 90% y 95% del teórico y en la industria varían entre 87 y 93% del rendimiento teórico, esto se debe a que la levadura utiliza la glucosa para reproducirse y para la producción de otros metabolitos5. También podría deberse a quela fermentación es parcial y no total.
En el caso del Índice de O/R , 0.1434, lo que nos dice que se esta cuantificando de mas o se estan perdiendo productos reducidos. Esto se debió al tamaño del vaso en el que se atraparía el CO2 que era de un area y volumen muy pequeño, al no atraparse todo el CO2 no se cuantifico y afecto esta relación. También al momento de pasar el contenido del vaso central pudo quedar un poco en él, y por ello no se cuantifico todo el CO2.

Conclusiones:
* La levadura Saccharomyces cerevisiae en condiciones de anaerobiosis realiza fermentación alcohólica produciendo etanol y CO2.
* El % de C recuperado fue bajo ya que del 87% (mínimo) se obtuvo un 52%.
* El Índice de O/R fue bajo, ya que por las dimensiones del vaso central no se atrapo todo el CO2 producido.
* El balance de fermentación arroja que los datos experimentales no se deben aceptar como correctos.

Bibliografía.
1 VOIT Torres N.V y (2002) “Analisis y optimización de fermentaciones”
2 PARÉS Ramón, FARRÀS, Antonio, 2008 “Bioquímica de los microorganismos”. Editorial reverte. Barcelona España. 1997. Pags. 43

3 ROSE H., Anthony Microbiología química, Introducción a la Fisiología Microbiana Ed. Alhambra

4PETRUCCI, Química General, (2006), Octava Edición Editorial Pearson,