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Laboratorio de fisiología y bioquímica microbiana - practica no. 2 “balance de fermentacion”INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Se llevara acabo la separación de compuestos volatiles por medio En el compartimento externo se coloca la muestra junto con el carbonato depotasio el cual funciona Primera etapa: oxidación Segunda etapa: oxidación Determinación de CO2 por gravimetría Después de la fermentación quedo una muestra en el vaso central, en esta muestra lo que paso fue que el dióxido de carbono liberado de la fermentación reacciona con el hidróxido de sodio formando bicarbonato de sodio el cual al estar en presencia de exceso de hidróxido de sodio, vuelve a reaccionar hasta formar carbonato de sodio. CO2 + NaOH NaHCO3 NaHCO3 + NaOH Na2CO3 + H2O Después la muestra se transfirió cuantitativamente sobre 20 ml de BaCl2 al 5% contenido en un matraz Erlenmeyer de 125 ml. Se hicieron 2 lavados, de dicho vaso central el cual contenía la muestra, con agua destilada libre de CO2 en este paso lo que ocurrió fue que el cloruro de bario reacciono con la muestra y se formo otra sal de carbonato de bario la cual precipito mejor debido al peso atómico del bario. Na2CO3 + BaCl2 BaCO3 + 2NaCl El precipitado deBaCO3 que quedo se recupero por filtración a través de papel filtro de Whatman No 1 de peso conocido. El papel con la muestra se deseca en una estufa a 60° C durante 20 y 24 horas y posteriormente haciendo uso del factor gravimétrico obtenemos la cantidad original de dióxido de carbono en milimoles. Determinación de Glucosa residual por el método de DNS. Para determinar la cantidad de glucosa residual se utilizo el método del 3 dinitrosalicílico (DNS), esto nos sirvió para calcular la cantidad de glucosa fermentada para posteriormente sacar los milimoles de glucosa este método se basa en la reducción del DNS (color amarillo) por la glucosa pasando a color rojo cuya presencia puede detectarse por lectura de la absorbancia a 540 nm. HIPOTESIS Si Saccharomyces cerevisiae lleva acabo el proceso de fermentación, entonces al ponerla en presencia de glucosa Objetivo General * Con los datos obtenidos experimentalmente, se realizara el balance de carbonos y el balance óxido-reducción. Discutira y evaluara el significado de dicho balance para la célula microbiana. Objetivos Particulares * Determinar cuantitativamente el etanol producido por el proceso de la fermentación llevada acabo por Saccharomyces cerevisiae . * Determinar cuantitativamente la cantidad de glucosa fermentada por Saccharomyces cerevisiae . *Cuantificar la cantidad de CO2 producido por la fermentación a partir de un método gravimétrico. * Conocer la cantidad de productos oxidados y reducidos y el porcentaje de carbono recuperado por medio de un balance de fermentación. REGISTRO DE DATOS. Tabla 1. Datos obtenidos para la curva tipo μg de etanol | Absorbancia a 445 nm | 0 | 1.394 | 250 | 1.346 | 500 | 1.284 | 1000 | 1.143 | 1500 | 1.048 | 2000 | 0.842 | 2500 | 0.771 | Tabla 2. Absorbancias obtenidas en la fermentación. | Muestras | Absorbancia a 445 nm | 0.2 mL de muestra fermentada | 0.983 | 0.5 mL de muestra fermentada | 0.636 | 1.0 mL de muestra testigo | 1.274 | Tabla 3. Datos obtenidos para la curva tipo de glucosa. | μg de Glucosa | Absorbancia a 540 nm | 0 | 0 | 100 | 0.590 | 200 | 0.927 | 300 | 1.422 | 400 | 1.613 | 500 | 1.789 | Tabla 4. Absorbancias obtenidas de la glucosa residual | Muestras | Absorbancias a 540nm | 0.2 mL de sobrenadante diluido 1:10 | 0.340 | 0.5 mL de sobrenadante diluido 1:10 | 0.637 | 1.0 mL de sobrenadante testigo diluido 1:10 | 0.064 | Tabla 5. Datos obtenidos para la cuantificación de CO2 | Muestras | Peso en gramos (g) | Papel filtro | 0.855 | Papel filtro + BaCO3 | 0.955 | BaCO3 de fermentación | 0.1 | Papel filtro Testigo | 0.842 | Papel filtro testigo + BaCO3 testigo | 0.901 | BaCO3 Testigo | 0.059 | MANEJO DE DATOS. Glucosa inicial Se utilizó 0.5mL de glucosa a 2M, por lo cual0.5*2M= 1mmol Curva tipo de Glucosa Grafico 1 curva tipo de glucosa por el método Glc. Interpolada Y=0.0036 x + 0.1633 (ECUACIÓN DE LA RECTA) Se despeja de la ecuación de la recta “x” para obtener la concentración x=Absorbancia-0.16330.0036 x= 0.340 -0.1633 =49μg 0.0036 Las absorbancias obtenidas se tienen en µg así que para realizar los calculos se debe pasar a mg. 49μg = 0.049mg Glc residual = (Glc interpolada) (1/alícuota) (FD) En este caso la alícuota tomada fue: * 0.2mL * 0.5Ml El factor de dilución fue 10 mg Glc/10ml = 0.049 mg x 5 x 10= 2.45 mg Glc/ml Los resultados obtenidos de los dos problemas deben de ser similares, por lo cual se llevara a cabo un promedio * Nota: Para el testigo se tomó una alícuota de 1mL y no se realizó dilución. Dado que este testigo carecia de glucosa se toma 0 de absorbancia. Por cualquier interferencia que pueda haber en el método o material utilizado, se debe obtener la glucosa residual real con la fórmula Glc residual real mg/mL=mg/mLde Glc residual Glc residual real mg/mL= 2.45+0= 2.45 mg/mL Glc fermentada = Glc inicial – Glc residual (real) Glc fermentada =180-2.45=177.55 La glucosa fermentada debe pasarse a mmol para el balance de fermentación: Pm Glc 180mg 1mmol Glc fermentada x1 x1 glucosa fermentada en mmoles=0.986mmoles ETANOL REDUCIDO y= 1.4064 – 0.0003 xDe la ecuación de la recta se despeja “x” para determinar la concentración x =y–1.4064 /- 0.0003 Grafico 2: curva tipo de etanol obtenido de fermentación alcohólica por el método de Conway. Etanol interpolado En “y” se sustituye las absorbancias obtenidas x (p0.2)= 0.983 – 1.4064 = 1411.3µg= 1.411mg -0.0003 x (t)= 1.121-1.40 = 441.3 µg= 0.441mg -0.0003 Se deben de tener en cuenta la alícuota que se tomó en este caso fueron: * 0.2 * 0.5 mg etanol= [etanol] x 1/ alícuota Los miligramos se piden en 10 mL por lo cual se multiplica por 10: mg etanol/10 ml= [etanol] x 1/ alícuota x 10 mg etanol/10mL(p0.2)= 1.411 x 5 x 10=70.55 mg etanol/10mL(t)= 0.441 x 1 x 10= 4.41 Por cualquier defecto que pueda tener el método o los instrumentos se debe sacar los mg de etanol reales. mg/10mL de etanol real = mg/10mL de etanol mg/10mL de etanol real = 70.55 – 4.41 = 66.14mg/10mL Pm del etanol 46 mg Etanol producido 46 mg -------- 1 mmol 66.41 --------- x2 X2 = 1.437mmol CO2 FORMADO NaOH + CO2 -----------> Na2CO3 + H2O Na2CO3 + CaCl2------->BaCO3 + NaCl (pp blanco) CUANTIFICAR BaCO3 ( PM= 197.3 mg/mmol ) CO2 ( PM= 44 mg/mmol ) Peso de la muestra (BaCO3) Problema= (Peso papel + muestra) – Papel Testigo= (Peso papel + muestra)- Papel P= 0.955-0.855 =0.1 g = 100 mg T= 0.901 – 0.842= 0.059g = 59mg BaCO3 Reales mgBaCO3 (Reales)=mgBaCO3 P– mgBaCO3T mgBaCO3 (Reales)= 100 – 54 = 41mg CO2 Formado mgCO2 formado = mgBaCO3 (reales) (PMCO2/PMBaCO3) mgCO2 formado = 41 (44/197.34)= 9.14mg CO2 Formado en mmol 44 mg -------- 1 mmol 9.14mg --------- x2 X2 = 0.207mmol Balance de fermentación: Ecuación de la fermentación alcohólica, donde por cada mol de glucosa se obtienen dos moles de etanol y dos de dióxido de carbono. Tabla 6: datos para el balance de fermentación alcohólica: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | Glucosa | 0.986mmol | 1 | 0 | ---- | --- | --- | Etanol | 1.437 mmol | 1.457 | -2 | ---- | -2.914 | 2.914 | CO2 | 0.207 mmol | 0.209 | +2 | 0.418 | --- | 0.209 | =0.418 | =2.914 | =3.123 | Acotaciones: 1 Glucosa utilizada y sus productos formados en mmoles. 2.-Cantidades de sustrato fermentadas y las de productos finales formados en mmoles de productos formados por 1mmol de sustrato (glucosa 3.-Estado de oxidación Productos oxidados 5.- Productos reducidos. %C recuperado= ( productos / 6)*100= 3.1236*100=52.05% I. O/R=productos oxidadosproductos reducidos =0.4182.914= 0.1434 Discusión: En los datos obtenidos de la practica de balance de fermentación se observa: En el caso de la glucosa se obtuvo que por 1mmol de glucosa se fermentaron 0.9854mmol, lo cual indica que practicamente casi toda la glucosa fue fermentada por la levadura. Los mmoles de etanol obtenido fueron 1.63, aunque el rendimiento teórico esperado era de1.97 ya que por cada mmol de glucosa se obtienen 2 mmoles de etanol. Esto podría deberse a que no se agrego la cantidad suficiente de carbonato de potasio ya que este es el agente liberador de los grupo –OH o que no se agrego el suficiente dicromato de potasio ya que este reactivo atrapara los iones –OH para ser oxidado a acetaldehído y ac. Acético. También podría deberse a que al momento Los mmoles de dióxido de carbono obtenidos fueron 0.2081 y el teórico esperado era de 1.97. Se observa un rendimiento muy bajo, esto podría deberse a que el tamaño Otras razones por las que se obtuvo un rendimiento bajo es que pudo entra un poco de oxígeno al matraz y se generó el efecto Pasteur, llevando el metabolismo de la glucosa a una respiración aerobia2, evitando la producción de etanol, por ello los birreactores se cierran herméticamente. Al observar el % de C recuperado se observa un porcentaje bajo, que es de 52% del rendimiento experimental varía entre 90% y 95% del teórico y en la industria varían entre 87 y 93% del rendimiento teórico, esto se debe a que la levadura utiliza la glucosa para reproducirse y para la producción de otros metabolitos5. También podría deberse a quela fermentación es parcial y no total. En el caso Conclusiones: * La levadura Saccharomyces cerevisiae en condiciones de anaerobiosis realiza fermentación alcohólica produciendo etanol y CO2. * El % de C recuperado fue bajo ya que * El Índice de O/R fue bajo, ya que por las dimensiones * El balance de fermentación arroja que los datos experimentales no se deben aceptar Bibliografía. 1 VOIT Torres N.V y (2002) “Analisis y optimización de fermentaciones” 2 PARÉS Ramón, FARRÀS, Antonio, 2008 “Bioquímica de los microorganismos”. Editorial reverte. 3 ROSE H., Anthony Microbiología química, Introducción a la Fisiología Microbiana Ed. Alhambra 4PETRUCCI, Química General, (2006), Octava Edición Editorial Pearson, Política de privacidad |
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