VALIDACION DE UN MÉTODO ANALITICO PARA LA DETERMINACIÓN DEL COBRE EN EL BANANO

VALIDATION OF ANALYTICAL METHODS FOR THE DETERMINATION OF COPPER IN THE BANANA







RESUMEN

En este trabajo se reporta la validación de un método espectrofotométrico por espectrometría de UV-VIS para la cuantificación del ion cobre en una muestra de banano. Bajo estas condiciones, el método analítico arroja parámetros estadísticos que permiten la cuantificación y la cualificación de este método.

PALABRAS CLAVES

Cobre, espectrofotometría, UV-VS, validación.

ABSTRAC

This paper reports the validation of a spectrophometric method for UV-VIS spectrometry to quantify the copper ion in a sample of bananas. Under these conditions, theanalytical.method yieldsstatistical parameters that allow quantification and qualification ofthis method.

KEYWORDS

Copper, spectrophotometry, UV-VS, validation

INTRODUCCION

El cobre es el tercer metal de transición más importante biológicamente después del hierro y del zinc. Se requieren unos 5mg en la dieta humana diaria. Una deficiencia de este elemento incapacita al cuerpo para utilizar el hierro almacenado en el hígado. Hay numerosas proteínas de cobre en todo el mundo vivo, y las más interesantes son las hemocianinas. Al mismo tiempo un exceso de cobre es en extremo venenoso, debido a la acumulación de cobre en el hígado, los riñones y el cerebro (enfermedad mal de Wilson) 1]

Es por ello que se han encontrado métodos de validación con los cuales se Pretende determinar la presencia del ion cobre en algunas frutas, en este caso el banano.

El banano orgánico maduro es un alimento muy digestivo, pues favorece lasecreción de jugos gástricos, por tanto es empleado en las dietas de personas afectadas por trastornos intestinales y en la de niños de corta edad. Tiene un elevado valor energético (1.1-2.7 Kcal/100 g), siendo una importante fuente de vitaminas B y C, tanto como el tomate o la naranja. Numerosas son las sales minerales que contiene, entre ellas las de hierro, fósforo, potasio y calcio.

Valor nutricional del plátano en (100 g.)

Banano forma parte de la clasificación del plátano

|Calorías: 85 Kcal |
|Agua: 75.7 g |
|Proteínas: 1.1 g |
|Carbohidratos: 22.0 g |
|Fibras: 0.6 g |
|Vitaminas A: 190 UI |
|B1: 0.05 mg |
|B2: 0.06 mg |
|B6: 0.32 mg |
|Acido nicotínico: 0.6 mg |
|Acido pentatónico: 0.2 mg |
|Otros componentes orgánicos |
|Acido málico: 500 mg |
|Acido cítrico. 150 mg |
|Sales Minerales: |
|Acido oxálico: 6.4 mg |
|Sodio: 4 mg |
|Potasio: 499 mg |
|Calcio: 3.0 mg |
|Magnesio: 37.0 mg |
|Hierro: 0.7 mg |
|Cobre: 0.0078 mg en 100g |
|Fósforo: 28.0 mg |
|Azufre: 12.0 mg |
|Cloro: 125.0 mg |


Espectrofotometría

Uno de los métodos utilizados es el de validación espectrofotometría en la región del visible, el cual sebasa en la capacidad de las moléculas para absorber radiaciones, entre ellas las radiaciones dentro del espectro UV-visible. Las longitudes de onda de las radiaciones que una molécula puede absorber y la eficiencia con la que se absorben dependen de la estructura atómica y de las condiciones del medio (pH, temperatura, fuerza iónica, constante dieléctrica), por lo que dicha técnica constituye un valioso instrumento para la determinación y caracterización de biomoléculas.

Las moléculas pueden absorber energía luminosa y almacenarla en forma de energía interna. Esto permite poner en funcionamiento ciclos vitales como la fotosíntesis en plantas y bacterias. Cuando la luz (considerada como energía) es absorbida por una molécula se origina un salto desde un estado energético basal o fundamental, E1, a un estado de mayor energía (estado excitado), E2. Y sólo se absorberá la energía que permita el salto al estado excitado. Cada molécula tiene una serie de estados excitados (o bandas) que la distingue del resto de moléculas. Como consecuencia, la absorción que a distintas longitudes de onda presenta una molécula -esto es, su espectro de absorción- constituye una señal de identidad de la misma. Por último, la molécula en forma excitada libera la energía absorbida hasta el estado energético fundamental 2]

En espectroscopía el término luz no sólo se aplica a la forma visible de radiación electromagnética, sino también a las formas UV e IR, que son invisibles.

En espectrofotometría de absorbancia se utilizan las regiones del ultravioleta (UV cercano, de 195-400 nm) y el visible (400-780 nm) 3]

Parámetros del método de Validación.

La validación es un proceso netamente experimental, efectuada mediante estudios de laboratorio, que permite evaluar o determinar la conveniencia o capacidad de un esquema analítico particular, cuyascaracterísticas de diseño cumplen con los requerimientos metodológicos y de resultados para la aplicación analítica propuesta; que involucra el desarrollo de un protocolo, que incluye la estimación de las medidas de precisión y exactitud aplicables a cualquier método analítico.

Cálculo de los atributos.

Son los que se derivan del proceso de validación, que identifican al método, dentro de los que podemos citar:

• & Límite de detección : mínima concentración detectable del analito que no puede cuantificarse

• & Límite de cuantificación : valor de la concentración a partir de la cual tiene significado cuantitativo

• & Exactitud :es el grado de proximidad entre una medida y el valor verdadero o esperado y está definido por la recuperación

• & Precisión : es el grado de proximidad entre resultados que se efectúan repetitivamente y en forma independiente y está relacionada con el coeficiente de variación

• & Sensibilidad: corresponde a la mínima cantidad de analito que puede producir un resultado significativo.

• & Rango útil : rango de concentración comprendido entre el límite de cuantificación y el límite de linealidad ( máximo valor de la concentración a partir de la cual no tiene significado cuantitativo)[4]

• 4.- Cartas de Control

Es el procedimiento interno que se realiza para verificar que el método validado cumple con los requisitos establecidos, permite llevar un registro diario del procedimiento, siempre que se haga una marcha analítica.





PROCEDIMIENTO

La técnica analítica a validar es un método de espectroscopia en la región del espectro visible para determinar cobre en el banano. El equipo espectrofotometría utilizado por la validación del método es shumacksu.

En primer lugar se tomo una solución patrón de 100ppm pesando 0.106g de di cloruro de cobre (CuCl2).Posteriormente se prepararon dos soluciones intermedias de 5ppm y 100ppm, a partir de la primera concentración se tomaron alícuotas de 0, 0.5, 5, 25 y 1.0 (ml). Cada solución se llevo a un aforo de 100ml y se le adiciono citrato de amonio 20%, dietilditiocarbomato de sodio, cloroformo. Con la segunda concentración se realizo el mismo procedimiento, pero tomando alícuotas diferentes de 5.0; 10; 20; 30 y 50 ml.

Con la solución patrón de 100ppm se realizo el barrido espectral de (400-500nm).

A continuación se leyó la absorbancia de cada una de las soluciones a la longitud de onda de máxima absorbancia que proporciono el barrido espectral, la cual fue de 440nm

Con los datos obtenidos se procedió a elaborar las curvas de Ringboon y de Crawford, con estas se determino los rangos entre los que se cumple la ley de Beer.

La segunda parte de la validación del método se centra en la determinación de rango de linealidad. Para esto fue necesario preparar soluciones de 5ppm y 100ppm, donde se determino que de 0.5ppm a 20ppm es donde se cumple la ley de Beer. Con estas soluciones se realizaron lecturas de absorbancia a su longitud de máxima absorbancia.

A partir de este rango de linealidad se obtuvieron diferentes lecturas de absorbancia, con el fin de realizar las curvas de Ringboon y Crawford.
Previamente se pesó 10g de banano. Posteriormente se calcinó. Y se le agregó 2 ml de acido clorhídrico, se calentó durante 1 min. A continuación se filtró, y se aforó a un volumen de 100ml. De esta muestra se tomó 10 ml y se aforó a 50 ml. Y se realiza la lectura de la absorbancia a la máxima longitud de onda. En las dos partes de validación se realizó un blanco, y se leyó su absorbancia 5 veces, con el objetivo de determinar el error del equipo.

RESULTADOS

Concentración corregida

až¢ Con respecto a la concentraciónintermedia de 100ppm



[pic]g[pic]

[pic]

[pic]

[pic]

[pic]

[pic]





až¢ En cuanto a la concentración intermedia de 5ppm



[pic]



až¢ Volúmenes corregidos (5ppm)

[pic]

[pic]

[pic]

[pic]

[pic]





Ahora reemplazamos y despejamos C2

C1V1=C2V2

[pic]

[pic]

[pic]

[pic]

[pic]







Barrido espectral

De las lecturas de absorbancia de las soluciones patrón de cobre se obtuvieron los siguientes resultados.

Tabla 1. Absorbancia y tramitancia de las soluciones patrón

|CONCENTRACION |ABSORBANCIA |TRAMITANCIA |
|(ppm) [C] |[A] |[T] |
|0,0114 |-0,072 |1,18 |
|0,1102 |0,08 |0,83 |
|0,5711 |0,255 |0,55 |
|5,0098 |0,617 |0,24 |
|10,019 |1,03 |0,09 |
|20,039 |1,08 |0,08 |
|30,058 |1,283 |0,05 |
|50,098 |1,387 |0,04 |


Tabla 2. Datos de la curva de Ringboon

|Log [ C] |100-%T |
|-1,9431 |-18 |
|-0,9578 |17 |
|-0,2433 |45 |
|0,6998 |76 |
|1,0008 |91 |
|1,3018 |92 |
|1,4778 |95 |
|1,6998 |96 |


Grafica 1. Curvade Ringboon

[pic]



Tabla 3. Datos curva de Crawford

|TRAMITANCIA (T) |dC/CdT |
|0,83 |-2,54 |
|0,55 |-2,88 |
|0,24 |-2,86 |
|0,09 |-3,33 |
|0,08 |-50,00 |
|0,05 |-11,11 |
|0,04 |-40,00 |


Grafica 2. Curva de Crawford

[pic]

En la segunda parte de la validación y de acuerdo a la curva de Ringboon se realizaron lecturas de absorbancia y se trabaja con el promedio.

Tabla 4: Absorbancias soluciones de trabajo

|[C]ppm |A1 |A2 |A3 |A4 |A5 |
|0 |0,046 |0,045 |0,046 |0,045 |0,045 |
|5,0 |0,045 |0,043 |0,043 |0,042 |0,042 |
|10 |0,540 |0,537 |0,527 |0,519 |0,517 |
|20 |1,13 |1,09 |1,075 |1,075 |1,070 |


Tabla 5. Absorbancia soluciones, regresión lineal

| |Concentración ppm[C] |Absorbancia |
|1 |0 |0,0454 |
|2 |5,0 |0,043 |
|3 |10 |0,528 |
|4 |20 |1,088 |


|∑ 35.5 |∑ 1,704 |
|[pic] 8,875 |[pic] 0,4261 |
|Pendiente (B) |0,057 |
|r |0,974 |
|r2 |0,949 |


Gráfica 3. Curva de calibración

[pic]

Tabla 6. Curva de calibración corregida|Concentración ppm [C] |Absorbancia corregida |
|0 |-0,058 |
|5,0 |0,202 |
|10 |0,491 |
|20 |1,069 |


Grafica 4. Curva de calibración corregida

[pic]



Tabla 7 .Datos estadísticos absorbancia y concentración de trabajo.

|[pic] |A-[pic] |A-[pic]2 |x-[pic]2 |X2 | |
|-0,058 |0,1034 |0,0107 |70,14 |0,25 |1 |
|0,202 |0,0252 |0,006 |15,01 |25 |2 |
|0,491 |0,037 |0,013 |1,265 |100 |3 |
|1,069 |0,019 |0,00036 |123,765 |400 |4 |


Para calcular los límites de detección y de cuantificación se obtuvieron los siguientes resultados:


Ecuación de la curva de calibración

[pic]


Tabla 8: Absorbancia del blanco

|BLANCO |A |
|1 |0 |
|2 |0 |
|3 |0 |
|4 |0 |
|5 |0 |
|PROMEDIO |0 |
|INTERCEPTO |0 |

až¢ Limite de detección y cuantificación del equipo shumacksu


YLDD=[pic] (1)


YLDC=[pic] (2)

Al ser las mismas Absorbancias del blanco en todas las lecturas el límite de detección y cuantificación es cero.


až¢ Sensibilidad del equipo

[pic] =-0,035 (3)






Tabla 9. Sensibilidad del método

|Concentración |Absorbancia |A2-A1 |S |
|ppm [C] | | | |
|0 |0,0454 |-0,0454 |-0,796 |
|5,0 |0,043 |-0,002 |-0,035 |
|10 |0,528 |0,485 |8,508 |
|20 |1,088 |0,56 |9,824 |



až¢ Precisión del sistema:
Hace referencia a la precisión del instrumento. La medida se realiza por medio de los cálculos del coeficiente de variabilidad (CV) que es equivalente a


CV=[pic] (4)


Donde [pic] es al desviación estándar de los datos.
De tal manera que si el valor del porcentaje obtenido es menor de 1 la precisión es buena.


Tabla 10. Precisión del sistema
|Ppm [C] |A |promedio |[pic] |CV |
|0,5 |0,046 |0,0454 |0,00054 |1,206 |
| |0,045 | | | |
| |0,046 | | | |
| |0,045 | | | |
| |0,045 | | | |
|5 |0,045 |0,043 |0,0012 |2,84 |
| |0,043 | | | |
| |0,043 | | | |
| |0,042 | | | |
| |0,042 | | | |
|10 |0,540 |0,528 |0,0103 |1,959 |
| |0,537 | | | |
| |0,527 | | | |
| |0,519 | | | |
| |0,517 | | | |
|20 |1,13 |1,088 |0,024 |2,26 |
||1,09 | | | |
| |1,075 | | | |
| |1,075 | | | |
| |1,070 | | | |


až¢ Exactitud se realizo con la longitud de onda de trabajo (1,088) y se reemplazo en los datos de la curva de calibración corregida


[pic]
(5)
[pic]

A partir de la ley de beer se obtiene

[pic] (6)


Error absoluto= E medido-valor esperado

EA= [20-19,08]=0,92ppm


[pic]


Con la ley de beer:

[pic]
Tabla 11: carta de control 1

|ppm [C] |A |[pic] |[pic]n-1 |
|0,5 |0,046 |0,0454 |0,00054 |
| |0,045 | | |
| |0,046 | | |
| |0,045 | | |
| |0,045 | | |

Tabla 12. Carta de Control 2
|[pic] + [pic]n-1 |0,0459 |
|[pic] - [pic]n-1 |0,0448 |
|[pic] +2 [pic]n-1 |0,0464 |
|[pic] -2 [pic]n-1 |0,0443 |
|[pic] + 3[pic]n-1 |0,0470 |
|[pic] -3[pic]n-1 |0,0437 |

VALOR TEORICO DEL BANANO:

0,078mg por cada 100g=0,0078mg
0,95mg por cada Kg

[pic]


Absorbancia de la muestra =0,089

[pic]

[pic]

[pic]

[pic]

Y por cada 100g =0.0015mg

ANALISIS DE RESULTADOS

Para realizar la validación del método fue necesario realizar la curva de Ringboon y determinar en que intervalo de concentraciones se cumple la ley de Beer. Se obtuvo entonces que las soluciones van de 0.5ppm a 20ppm de cloruro de cobre cumplen laley de Beer, por lo cual estas fueron las soluciones patrón o de trabajo empleadas para la validación del método analítico.

En primer lugar para la validación de método analítico se hace necesario determinar la precisión y exactitud del sistema, así como también reconocer los posibles errores sistemáticos e instrumentales, que puedan afectar las mediciones realizadas y por ende reflejar que la técnica analítica no es la adecuada para determinar nitritos.

Con respecto a la precisión del sistema se determino una desviación no tan considerable en los datos, debido a que el coeficiente de variación es un poco mayor que 1, pero no es tan lejano a este (ver tabla 12). Se observa que el coeficiente de variación no es tan elevado, lo que indica que la desviación no es mucha. Esto determina que la precisión es mínima, pero que tiene poca exactitud.

Estos valores obtenidos pueden ser resultado de errores sistemáticos y relacionados principalmente con el espectrofotómetro Shumacksu. El equipo resulta apropiado para realizar la validación de una técnica analítica espectrofotométrica, debido a su adecuada calibración. El equipo se calibra automáticamente permitiendo realizar su función adecuadamente.

En cuanto a los límites de detección y cuantificación del equipo se encontró que estos tienen un valor de cero, lo cual indica que son capaces de detectar y cuantificar concentraciones de analito, debido a que estos límites se encuentran cercanos al rango de linealidad. A su vez los LDD y LDC del equipo permitieron detectar y cuantificar satisfactoriamente concentraciones muy bajas.

Otro factor que determina la precisión y exactitud del equipo es su sensibilidad, la cual se puede abordar desde dos perspectivas, la primera hace referencia a la sensibilidad de detectar las energías producidas por la excitación electrónica de losátomos del análito, la cual se describe principalmente por los LDD y LDC ya mencionados. La segunda sensibilidad se centra en la seguridad frente a factores externos tales como: vibraciones abruptas, temperatura, presión entre otros. Al calcular la sensibilidad del equipo, esta presentó un valor bajo de (-0,035), lo cual indica que el equipo no arroja una señal confiable a concentraciones bajas de cobre.

Abordando ahora el método utilizado para la determinación de cobre, se tiene que su precisión de variabilidad (C.V) es de (1,206), lo que demuestra que el método se llevo a cabo correctamente. Sin embargo, los datos de las Absorbancias utilizadas para este análisis son inherentes al sistema y a la ecuación de la recta obtenida en la curva de calibración, con la cual se calcula la concentración experimental de la solución. La ecuación se encuentra directamente relacionada con las Absorbancias proporcionadas por el equipo.

Cabe resaltar que el % de error es bajo (4 %), lo que indica que el método de validación utilizado en la práctica es muy preciso, pero no es exacto.


Por otro lado y teniendo en cuenta las tablas nutricionales del banano se encuentra que esta fruta tiene un bajo contenido de cobre (0.078mg por cada 100g). O (0,98mg por cada Kg). Durante la practica de laboratorio se determino que el contenido de cobre en el banano es de 0,0015mg por cada 100g de cobre, lo que indica que este valor es permisivo según los valores nutricionales, su baja magnitud se debe en primera medida a que el banano contiene una mínima cantidad de cobre, A su vez de que la cantidad de muestra tomada fue muy pequeña (10g).

Finalmente, es necesario tener encuentra que el tratamiento y posterior análisis estadístico realizado a los datos obtenidos, corrigió y minimizo en cierta medida los errores sistemáticos que pudieran presentarseaž¢ La técnica analítica es valida para determinar cobre a pesar de los errores relacionados con el equipo que se presentaron, debido a que estos son ajenos a la técnica analítica.
až¢ Gracias a la espectrofotometría visible y ultravioleta es posible determinar cuantitativamente y cualitativamente con la ayuda de reactivos específicos y el desarrollo de coloración moléculas orgánicas e inorgánicas en solución o en muestras biológicas, lo que constituye una gran técnica analítica, sencilla y eficaz.


CONCLUSIONES


až¢ La concentración de cobre en la muestra fue de 0,0015mg por cada 100g


až¢ La técnica analítica utilizada resulta sencilla y eficaz para determinar la concentración de cobre en determinada fruta en este caso.

až¢ Gracias a la espectroscopia visible y ultravioleta es posible determinar cuantitativamente y cualitativamente con la ayuda de reactivos específicos y el desarrollo de coloración de moléculas orgánicas e inorgánicas en solución o en muestras biológicas, lo que constituye una gran técnica analítica, sencilla y eficaz.


BIBLIOGRAFIA

RAYNER, Geoff. Química inorgánica descriptiva. México 2000

GRAL, CLAUDIA ROSANA Y PASOTTI, NATALIA. Espectrofotometría visible-ultravioleta. Agrimensura 2006

MILLER, J.C Estadística para química analítica. Editorial Addison Wesley Iberoamericana. Segunda edición, 1993.

www.itescam.edu.mx/principal/sylabus/fpdb/recursos/r22541.DOC.











































[1] RAYNER, Química inorgánica descriptiva. 2ediccion 2000
[2] GRAL, CLAUDIA ROSANA Y PASOTTI, NATALIA. Espectrofotometría visible-ultravioleta. Agrimensura2006
[3] IBID
[4] MILLER, J.C. Estadística para la química analítica.Editorial Addison Wesley iberoamericana