REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

INTRODUCCIÓN
Una de las técnicas principales empleadas en el laboratorio clínico es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Esta técnica fue desarrollada en 1985 por Kary Mullis; el PCR ha revolucionado la genética molecular, haciendo posible el estudio y analisis de una amplia gama de genes, que incluso pueden obtenerse a partir de un genoma completo, como es el de los mamíferos donde pueden existir alrededor de cien mil genes.
La técnica de PCR se basa en la replicación del ADN en los organismos eucariontes y procariontes realizada por la ADN polimerasa. Esta enzima realiza la síntesis de una cadena complementaria de ADN en el sentido 5—3 usando un molde de cadena sencilla, pero a partir de una región de doble cadena. Para crear esta región doble cadena se usan los denominados iniciadores (cebadores o primers). Estos cebadores son secuencias de nucleótidos de cadena simple complementarias a la secuencias de nucleótidos que flanquean la secuencia de DNA.

La sensibilidad del diagnóstico de PCR es muy alta, ya que se producen varios millones de copias de la diana seleccionada. También puede ser muy alta la especificidad de la reacción debida a las secuencias mucleotídicas específicas formadas por los oligonucleótidos(cebadores).
PCR CLASICO O UNIVERSAL
Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas paraseparar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que vuelvan a unirse a polimerasas para que vuelvan a duplicarlas. Puesto que las temperaturas del ciclo (95 °C en las fases de desnaturalización del ADN) suponen la inmediata desnaturalización de toda proteína, se emplean ADN polimerasas termoestables, extraídas de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivas para la mayoría de los seres vivos. Dichos microorganismos, generalmente arqueas, son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus termophilus (Tth).
La región amplificada se caracteriza por cebadores; éstos son secuencias cortas, normalmente de 18 a 22 nucleótidos, que son reconocidos por la polimerasa permitiendo iniciar la reacción y que son complementarios con las regiones de ADN que flanquean la secuencia diana. Se hace uso de una solución tampón (buffer) que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa.
Repitiendo de 20 a 30 veces el régimen de ciclos de calentamiento, se obtendra una cantidad de ADN diana copiado que sera suficiente para operaciones ulteriores, tales como la detección, el clonado y la secuenciación. Si se parte de una molécula única de ADN en la muestra inicial y en cada ciclo se duplica el número de moléculas, al final de los 30 ciclos, se obtendra 230 moléculas idénticas.

Finalmente, en la tercera etapa se lleva a cabo la detección de losfragmentos amplificados en la PCR (amplicones) por electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio, o mediante hibridación con sondas específicas. En general todo este proceso suele durar aproximadamente 24h.

Nota:
La cromatografía es la técnica que separa una mezcla de solutos basada en la velocidad de desplazamiento diferencial de los mismos que se establece al ser arrastrados por una fase móvil.
Los tamaños de los productos de PCR se determinan comparando los mismos, con marcadores que contienen fragmentos de ADN de tamaño conocido los cuales se corren en el gel junto a los productos de PCR.

PCR TIEMPO REAL

La PCR en tiempo real o PCR cuantitativa es una variante de la PCR que permite cuantificar ademas de detectar y amplificar secuencias de ADN.
Fundamento: En PCR a tiempo real, los procesos de amplificación y detección se producen de manera simultanea en el mismo vial cerrado, sin necesidad de ninguna acción posterior. Ademas, mediante detección por fluorescencia se puede medir durante la amplificación la cantidad de ADN sintetizado en cada momento, ya que la emisión de fluorescencia producida en la reacción es proporcional a la cantidad de ADN formado. Esto permite conocer y registrar en todo momento la cinética de la reacción de amplificación. Los termocicladores para llevar a cabo la PCR a tiempo real incorporan un lector de fluorescencia y estan diseñados para poder medir, en cualquier momento, la fluorescencia emitida en cada uno de los viales donde serealice la amplificación. Los sistemas de detección por fluorescencia empleados en la PCR a tiempo real pueden ser de dos tipos: agentes intercalantes y sondas específicas marcadas con fluorocromos.
Agentes intercalantes
Son fluorocromos que aumentan notablemente la emisión de fluorescencia cuando se unen a ADN de doble hélice. El mas empleado en PCR a tiempo real es el SYBR Green I .
El incremento de ADN en cada ciclo se refleja en un aumento proporcional de la fluorescencia emitida. Este sistema de detección tiene la ventaja de que la optimización de las condiciones de la reacción es muy facil y ademas, es mas barato que las sondas específicas. El principal inconveniente de los agentes intercalantes es su baja especificidad, debido a que se unen de manera indistinta a productos generados
inespecíficamente o a dímeros de cebadores, muy frecuentes en la PCR.
Sondas de hibridación específicas
Son sondas marcadas con dos tipos de fluorocromos, un donador y un aceptor. El proceso se basa en la transferencia de energía fluorescente mediante resonancia (FRET) entre las dos moléculas. Las mas utilizadas son las sondas de hidrólisis, denominadas también sondas TaqMan, las sondas molecular beacons y las sondas FRET.

IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE Clostridium tyrobutiricum POR PCR A TIEMPO REAL EN MUESTRAS DE LECHE
Microrganismo: Clostridium tyrobutyricum
Microorganismo Gram+, anaerobio estricto, mesófilo, formador de esporas y altamente resistente en el medio ambiente (suelos,aguas, ensilados, etc). Produce acido butírico por fermentación del acido lactico, lo que conduce a la formación de cavidades irregulares en la masa del queso por la producción de gas. Es el principal agente responsable de la alteración denominada “hinchazón tardía” que ocurre en quesos curados y semicurados.
TRATAMIENTO Y OBTENCIÓN DE LA MUESTRA: leche
Cultivo microbiano. Las cepas utilizadas en el estudio crecieron en medios y condiciones de cultivo recomendadas (haciendo diluciones).
Extracción de ADN microbiano. purificación de ADN microbiano a partir de leche, se optimizó un método de extracción basado en un tratamiento con tritón X-100( se usa frecuentemente como un auxiliar de disolución para proteasa en agua), tripsina (rompe los enlaces de las proteínas mediante hidrólisis para formar péptidos de menor tamaño y aminoacidos.), lisozima(rompe las paredes celulares de las bacterias), distintos tampones de lisis y purificación con columnas de silica gel (se usa como agente desecante para controlar la humedad). El ADN se cuantificó a 260 nm y mediante electroforesis en gel de agarosa.
PCR a tiempo real.
Muestra: 20 ml de volumen total
Contiene:
• sondas TaqMan;
• cebador:
a) cebador CTflaF (5’-CAA GGC TTC AAT TCC GGT GAT GCC-3’)
b) cebador CTflaR (5’-TGG TCC GGT TCA TAC TCG GGC TGG-3’)
• El sistema de PCR amplifica una región del gen flagellin(fla)
• Sistema de PCR a tiempo real 7500 (Applied Biosystems)
• Los resultados se analizaron con el software System SequenceDetection 7500 v1.2.2 (Applied Biosystems).
Constó de tres pasos en cada ciclo:
1. Desnaturalización del ADN doble cadena: La doble hélice de ADN se separa en dos hebras por calor. Se trata de una etapa crítica ya que es muy importante que el ADN molde se desnaturalice completamente. Para lograrlo de manera adecuada se incuba a temperaturas de 95 ºC durante 2 minuto. (La temperatura a la cual se decide realizar la desnaturalización depende de la proporción de G+C de la hebra, como también del largo de la misma).
2. Hibridación de los iniciadores a la zona 3´ específica de cada una de las hebras: Los cebadores o primers que se usaron y se unen a las zonas 3´ complementarias que delimitan las regiones que se van a amplificar. Se realiza gracias a la disminución de la temperatura (60º C).
Son oligonucleótidos marcados con un fluorocromo donador en el extremo 5’ que emite fluorescencia al ser excitado y un aceptor en el extremo 3’ que absorbe la fluorescencia liberada por el donador. Para que esto ocurra, las moléculas donadora y aceptora deben estar espacialmente próximas. Ademas, el espectro de emisión de la primera se ha de solapar con el espectro de absorción de la segunda. Mientras la sonda esta intacta, la fluorescencia emitida por el donador es absorbida por el aceptor.
3. Extensión del cebador por actuación de la DNA polimerasa
La ADN polimerasa (llamada polimerasa Taq, aislada de la bacteria Thermus aquaticus), actúa tomando el ADN molde para sintetizar la cadenacomplementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde añadiendo los dNTP's complementarios en dirección 5'→ 3', uniendo el grupo 5'- fosfato de los dNTPs con el grupo 3'- hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente (la cual se extiende).
Durante la amplificación de ADN diana, la sonda se hibrida con su cadena complementaria. Al desplazarse a lo largo de la cadena, en su acción de síntesis, la ADN polimerasa de Thermus aquaticus, que tiene actividad 5’ exonucleasa, hidroliza el extremo libre 5’ de la sonda, produciéndose la liberación del fluorocromo donador7. Como donador y aceptor estan, ahora, espacialmente alejados, la fluorescencia emitida por el primero es captada por el lector.


Fig 1. Actuación de la doble cadena ADN con la sonda marcadora.

Figura 2. Reacción en Cadena de la Polimerasa, se observan los ciclos del proceso: Paso1) Desnaturalización; Paso 2) Hibridación; Paso 3) Extensión

En cada ciclo de PCR se duplica la secuencia de interés (del gen flagelina), por lo que en solo 25 ciclos teóricamente habra millones de copias, a lo que se conoce como “amplificado”, lo que facilitara enormemente su analisis posterior (Figura 2). En la mayoría de las reacciones, la etapa de extensión se realiza a 72ºC. El tiempo de extensión depende del tamaño de la amplificación.

Figura 3. Amplificación exponencial de una secuencia de ADN por ciclos detemperatura por la técnica de PCR

Resultados
El sistema de PCR a tiempo real se diseñó con el software Primer Express v.2.0 sobre el gen flagelina de C. tyrobutyricumy permite identificar esta especie con una especificidad del 100%.
Ademas se demostró que el sistema identifica distintas cepas de la misma especie. La capacidad de cuantificación del método de PCR se calculó sobre diluciones seriadas de ADN total de C. tyrobutyricum observando su amplificación hasta 10 equivalentes genómicos (figura 1). La capacidad de analisis del sistema se probó en leche contaminada experimentalmente (tres experimentos independientes) con distintas diluciones de esporas obtenidas en el laboratorio de C. tyrobutyricum.

Conclusiones
El sistema de PCR a tiempo real diseñado permite la identificación inequívoca y la cuantificación de C. tyrobutyricum en muestras de leche.
APLICACIONES DE LA PCR CLASICO
BIOLOGÍA MOLECULAR Clonación molecular de genes y su secuenciación nucleotídica.
ANALISIS Y CUANTIFICACIÓN DE LA EXPRESIÓN GENÉTICA Basado en el estudio de la cantidad de RNA mensajero (RNAm).En estos casos se requiere de la síntesis de un DNA copia (DNAc), a partir del RNA muestra, por medio de la enzima transcriptasa reversa.
DIAGNÓSTICO CLÍNICO En la genética médica para el diagnóstico de enfermedades hereditarias y de algunas cromosomopatías comunes.
INMUNOLOGÍA Para determinar asociaciones entre el complejo mayor de histocompatibilidad y la predisposición genética para el desarrollo de enfermedadesautoinmunes.
ONCOLOGÍA Para detectar arreglos cromosómicos presentes en procesos neoplasicos y para la detección de virus y de las secuencias oncogénicas.
MICROBIOLOGÍA Diagnóstico rapido y preciso de infecciones producidas por bacterias, hongos y virus. Por ejemplo, en el caso del genero Mycobacterium.
BIOTECNOLOGÍA Para la identificación rapida y temprana de animales y plantas transgénicos.
ANTROPOLOGÍA Y GEOLOGÍA Se ha amplificado DNA de restos humanos momificados del faraón Tutankamon (hace 3.000 años)

VENTAJAS Y DESVENTAJAS DEL PCR CLASICO
VENTAJAS DESVENTAJAS
A partir de una muestra pequeña de ADN se puede obtener una cantidad considerable para el estudio que se vaya a realizar. Se puede reproducir solamente partes del genoma en donde se conoce por lo menos una mínima secuencia de 20 – 40 pb.

El producto se puede utilizar para clonar, secuenciar y analisis. Se necesitan “primers” específicos que sean complementarios al fragmento que se desea sintetizar.
Se puede amplificar ADN de cualquier organismo vivo o muerto.
Sus aplicaciones son múltiples: medicina forense, diagnósticos, analisis prenatales, etc.



Figura 4. PCR en tiempo real

APLICACIONES DE LA PCR EN TIEMPO REAL
DETECCIÓN/CUANTIFICACIÓN/GENOTIPIFICACION DE PATÓGENOS Virales, bacterianos, protozoarios, hongos
DIAGNÓSTICOS TEMPRANOS Pacientes asintomatico
DETECCIÓN DE GENES DE RESISTENCIA – MEJOR ELECCIÓN DE TERAPIA.
MONITOREOS DE TERAPIA.
DETECCIÓN DE MARCADORES TUMORALES
ESTADO DEDESARROLLO/PROGRESIÓN DE LA ENFERMEDAD.

VENTAJAS Y DESVENTAJAS DEL PCR EN TIEMPO REAL
VENTAJAS DESVENTAJAS
Simple y rapida (semi- automatizada). Costo e infraestructuras.
No hay manipulación post-PCR: disminuye el riesgo de contaminación por amplicones fragmentos de ADN amplificados previamente en el laboratorio que pueden contaminar reactivos, superficies y materiales y producir resultados falsos positivos).
Alta sensibilidad y especificidad.
Objetividad en la interpretación y monitorización de tratamiento.
Detecciones de parasitemias mixtas.
PCR clasico Vs. PCR tiempo real

PCR CLASICO PCR TIEMPO REAL
Los productos son detectados al final de la prueba.
Prueba de detección simultanea durante el proceso de amplificación.

Detección por empleos de geles de agarosa aparte de la reacción de PCR.
Detección mediante fluorescencia
Poder de resolución limitado.
Detección de cambios mínimos y con cantidades pequeñas de ADN blanco.

Obtención de resultados en dos pasos (amplificación y detección).
Prueba simultanea (amplificación y detección).

Mayor tiempo en la obtención de resultados.
Inicialmente la técnica era lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo. Menor tiempo en la obtención de resultados.


REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
1. Torres T. Alfredo, Baca E., Reacción en cadena de la polimerasa, Centro de Investigaciones Microbiológicas. Instituto de Ciencias,Universidad Autónoma de Puebla. Nº 23, Vol. 3, 1995 pp. 16-21.
2. Rodak F. Bernadette, Hematología, Fundamentos y aplicaciones clínicas, 2º Edición, Editorial Médica Panamericana. 2002
3. Gonzalez F. Tania, Rojas H. Rafael. Unidad Sureste del Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco, A. C. Guadalajara, Jalisco, México.
4. Molina, Marycelle. 'Material Didactico para el curso Laboratorio de Criminalística'. U.N.E.D., versión preliminar, segunda parte, 1998, pag.74
5. Osorio M. Fundamentos de la reacción en cadena de polimerasa “PCR” y su aplicación en alimentos, Grupo de Investigaciones Mellitopalinologicas y Propiedades Fisicoquímicas de Alimentos, Universidad del Tolima, 30 de Abril de 2009
6. Dorado P. Gabriel, Amplificación de DNA mediante PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa), Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 14071-Córdoba.
7. Penacino G. Adolfo, Actualización en estudios de paternidad por analisis de ADN, Informedica 2002: Preparando el Camino para la e-Salud Global 2do Congreso Virtual Iberoamericano de Informatica Médica Nov. 4 - Nov. 30, 2002 en Internet.
8. Validación y control de calidad de los métodos de Reacción en Cadena de la Polimerasa utilizados para el diagnóstico de enfermedades infecciosas. Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuaticos 2006.
9. Dr. Rangel V. Héctor, Asesor Científico DNA Profile SC, La prueba de paternidad con ADN.