Introducción
La fotometría o espectrofotometría es una técnica bioquímica utilizada para determinar la concentración de diversas sustancias .La espectrofotometría es el método de análisis óptico más usado en las investigaciones biológicas. El espectrofotómetro es un instrumento que permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia.
Todas las sustancias pueden absorber energía radiante, aun el vidrio que parece ser completamente transparente absorbe longitud de ondas que pertenecen al espectro visible; el agua absorbe fuertemente en la región del infrarrojo. La absorción de las radiaciones ultravioleta, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las moléculas, y es característica para cada sustancia química. Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energía es absorbida; la energía radiante no puede producir ningún efecto sin ser absorbida. El color de las sustancias se debe a que éstas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbida.

La espectrofotometría usa la luz del espectro electromagnético yusa radiaciones del campo ultravioleta principalmente de 200 a 400 nm y usa la luz visible de 400 a 800 nm, por lo que es de gran utilidad para caracterizar las soluciones en la región ultravioleta visible del espectro.
Al campo de luz ultravioleta de 200 a 400 nm se le conoce también como rango de ultravioleta cercano, la espectrofotometría solamente usa el rango del campo electromagnético de la luz visible, de 400 a 800 nm. A este tipo de técnicas se conoce en conjunto como técnicas bioquímicas, en relación a la espectrofotometría se tiene una ley muy importante, la ecuación simplificada de beer-lambert A = ε.d.c comprende a la mínima ecuación que relaciona la concentración (c), la absorbencia de la muestra (A), el espesor recorrido por la radiación (d) y el factor de calibración (ε). El factor de calibración relaciona la concentración y la absorbencia de los estándares. A parte del método de espectrofotometría y fotocolorimetría se tiene los métodos de centrifugación diferencial, electroforesis, análisis de sedimentación, etc.
 
 
 
 
 
Objetivos
 
• Obtener el espectro de absorción de BSA con agente biuret
 
• Determinar la concentración de BSA en la muestra desconocida de esta proteína usando una curva de calibración.
 
Procedimientos 
En este experimento se trabajara con la proteína BSA (bovine serum albumin) en agua. Se le proveerá una solución concentrada de BSA (10 mg/mL) y envases con agente biuret, a partir de esta solución prepara sus soluciones diluidas. Los espectros de absorción se obtendrán en el espectrofotómetro Hewlett-Packard UV/VIS.
 
• Prenda el Spectronic 20 y deje calentar la lámpara por 15min. Luego que el equipo caliente calibre el instrumento.
 
• Limpie 5 celdas. Utilice las pipetas correspondientes para preparar 4 disoluciones que contengan 2, 5, 8 y 10 mg de BSA y llevara la solución a un volumen final de 1 mL con agua destilada. El tubo # 5 le añade 1 mL de la solución desconocida de BSA. Estas serán sus soluciones estándar.
 
• A los 5 tubos (o celdas) se le añadirán 4 mL del agente biuret. Recuerde agitar bien el tubo, deje reaccionar por 30 minutos a temperatura ambiente.
 
• Para calibrar el Spectronic 20 lleve el monocromador a 300NM y con el botón a 300 nm. Luego con el botón de 0%T lleve la aguja del instrumento al 0%T (recuerde que esto se hace sin celda adentro). Una vez haga esto ese botón no se vuelve a tocar durante el experimento de moverlo tendrá q repetir este paso de nuevo.
 
• Ahora coloque un Tubo (celda) que contenga Ÿ deagua destilada este será su blanco y llevara el 100%T a 100%T en la escala del instrumento. Ahora puede comenzar a medir el %T de sus muestras al “Landa Max” (550 nm).
 
• Después que pasen los 30 minutos calcule él %T de cada una de los 5 tubos con las soluciones. Recordando que siempre debe calibrar el 100%T (con el blanco) cada vez que cambie de solución.
 
• Calculo la Absorción usando la ecuación :  
 
• Descarte las soluciones en los envases de desperdicios, Deje su área de trabajo limpia.
 
Datos
 
Para crear las disoluciones partimos de una solución madre de BSA en agua que posee una concentración de 10mg-
/ml. a€‹Para las soluciones se calcula cuanto de BSA se necesitaba y cuanto de agua destilada se necesitaba para llegar a un 1 mL. En el primer tubo se le colocara 2 mg/ml si partimos de la premisa que 10mg = 1 mL de BSA pues podemos determinar cuánto es la cantidad de cada una de las soluciones. En el tubo #1 se usaron 2mg/mL usando la estequiometria podemos determinar que se utilizaran 0.20 mL de BSA y 0.80 mL de agua destilada para llegar a 1 mL. En el tubo #2 se usaron 5mg/ml aplicando la misma razón estequiometria esto sería 0.50 mL de BSA y 0.50 mL de agua. El tubo #3 es de 8mg/ml este sería de 0.80 mL de BSA y 0.20 mL de agua. Enel tubo #4 se usaron 10mg/ml en este caso como 10 mg son 1ml pues no se tenía q utilizar el agua para llegar a la medida asignada.
 
Tabla de datos (%t550 Vs Concentración de BSA
# de Celdas
%T 550
Concentración de BSA
Tubo 1 (2mg/ml)
68.5
M
Tubo 2 (5mg/ml)
48.5
 
Tubo 3 (8mg/ml0
33.2
 
Tubo 4 (10mg/ml)
29.8
 
Tubo 5 (desconocido diluido)
62.8
9.69 x 10-6 M
Tubo 5 (desconocido sin diluir)
45.6
1.78 x 10-5 M
 
a€‹El valor del %T (a 550 nm) del desconocido fue 45.6 (con 1.0 ml de desconocido) este valor fue sin diluir la sustancia. Cuando diluimos la misma a 0.50 ml de desconocido y 0.50 ml de agua destilada el valor del %T (a 550 nm) fue de 62.8 ósea que mientras mayor sea la concentración más bajo será su %T.
 
 
 
 
 
Cálculos
 
Las concentraciones las determinamos de la siguiente forma:
 
= Molaridad de la solución
 
Ejemplo:
 
 
La absorción de cada una de las muestras se determino de la siguiente forma.
 
 
Un ejemplo de ello sería:
 
 
 
 
Tabla de las absorciones obtenidas
# de Celdas
Absorción obtenida (550 nm)
Tubo 1 (2mg/mL)
0.16
Tubo 2 (5mg/mL)
0.31
Tubo 3 (8mg/mL)
0.48
Tubo 4 (10mg/mL)
0.52
Tubo 5 (desconocido diluido)
0.20
Tubo 6 (desconocido sin diluir)
0.34
 
 
 
 
 
 
  
 
Con la ecuación de la gráfica podemos determinar concentración del Desconocido
Ejemplo: (y = mx + b) donde “y” es la absorbencia, la “m” es la pendiente, “X” es la concentración y “b” es el intercepto en y.
 
 
 
 
Discussion
 
En este experimento estuvimos trabajando con BSA ( albumin serum of bovine) lo cual es una proteína que posee la capacidad de absorber luz en regiones UV/Visible en incluso posee la capacidad de emitirla.Normalmente BSA en H2O absorbe en la región de 279nm. BSA puede lograr emitir luz gracias a la presencia en su contenido del amino acido Triptofano; el amino acido posee una estructura (C11 H12 N2 O2) y es un compuesto muy interesante y necesario para el cuerpo humano y otros mamíferos. Es un aminoácido necesario para el crecimiento normal en los bebés y para el equilibrio de nitrógeno en los adultos. Es un aminoácido esencial, lo cual significa que el cuerpo no lo puede producir y se debe obtener de la alimentación.El cuerpo utiliza el triptófano para ayudar a producir la niacina y la serotonina. Esta última se cree que produce un sueño saludable y un estado de ánimo estable.
En el experimento realizamos una mezcla entre BSA + Biuret+ H2O partiendo de una [ ] stock de BSA a 10mg/ml. Ademas realizamos cincodilusiones de la [ ] de BSA.
En la mezcla de biuret + BSA descubrimos que la sustancia absorve a un landa max. de 550nm. Si comparamos la absorvancia de de la mezcla y BSA (solo) podemos ver que a la absorvancia aumento su region por 270nm. Para realizar fotometrias debemos de poseer el conocimiento de realizar dilusiones de sustancias para variar la concentracion de una sustancia requerida, esto nos ayudara a determinar la concentracion y cantidad de una sustancia desconocida por medio de la fotometria. Para el estudio de la fotometria debemos saber calibrar correctamente el espectrofotometro utilizando un blanco para corregir la medida, ya que esto afecta la lectura de nuestra muestra. Ademas debemos de estar seguros de que estamos colocando correctamente la laminilla en la maquina y que el cristal este completamente limpio para que la grasa de nuestros dedos no afecte la lectura. En la lectura de absorvancia es importante obtener la lectura en la escala de % tramitancia, ya que es una escala mas sertera y el margen de error es menor. Es decir la fotometria contiene varios procedimientos de cuidado a la hora de realizarla ya que debemos estar correctos en las dilusiones, calibraciones y toma de lecturas para poseer el menor margen de error posible.