PROTOCOLO DE ANÁLISIS PARA UNA MUESTRA RICOTTA

Introducción
La Ricotta entra dentro de la clasificación de los quesos como tipo requesón, que como característica destacada tiene un alto porcentaje de humedad (aproximadamente 70%).
Los m.o. que podemos encontrar en este tipo de alimento y que debemos son los q se detallan en la tabla que sigue a continuación.

Microorganismos y limites dados por bromatología:

|Microorganismo |n |c |m (ufc/g) |M (ufc/g) |
|Coliformes totales (a 30a°C) |5 |3 |100 |1000 |
|Coliformes fecales (a 45a°C) |5 |2 |10 |100 |
|Staphylococcus Aureus |5 |2 |10 |100 |
|Hongos y levaduras |5 |2 |500 |5000 |
|Salmonella spp |5 |0 |ausencia en 25g |----- |
|Listeria Monocytogenes |5 |0 |ausencia en 25g |----- |

Muestreo:
Se toman 5 trocitos de muestra con sacabocados en condiciones asépticas de tal forma que se atraviese elbloque de queso de cáscara a cáscara y que su peso no exceda mucho mas allá de los 40g (solo se requerirán 35g en total), inmediatamente se deposita en frasco estéril la muestra que debrá ser analizada en el mismo día, pero si no se analiza inmediatamente se debe mantener en refrigerador.

RECUENTOS

Para el recuento se utilizará el método de NMP para estudiar la cantidad de ufc presentes en la muestra y determinar si cumple o no con las estipulaciones dadas por bromatología (ver tabla arriba

Preparación previa de la muestra :
Pesar 10g de muestra obtenida en condiciones asépticas y diluir en 90ml de suero fisiológico estéril, a esta llamaremos dilución (-1).
Tener en cuenta que todo se hará por duplicado.



Recuentos de Coliformes
1- Ensayo coliformes totales
Ensayo presuntivo
1- Colocar en una gradilla nueve tubos con medio CLT de simple concentración con campana de Durham, para hacer la serie 3-3-3 .
2- Agitar vigorosamente la muestra para homogeneizar la suspensión.
3- Pipetear 1ml de la muestra y diluir en 9ml de SF dilución (-2).
4- Sembrar 1ml de la dilución (-1) en la primera serie de tubos, 1ml de la dilución (-2) en la segunda serie de tubos y 0.1ml de la dilución (-2) en la tercera serie de tubos. Rotular adecuadamente de forma de identificar el tubo con la dilución sembrada.
5- Mezclar cada uno de los tubos por agitación suave.
6- Incubar los tubos a 35 ± 0.5 a°C. Luego de 24 ± 2 h agitar los tubos suavemente y observar.
7- Considerar tubos positivos presuntivos a los quepresentan turbidez debida al crecimiento bacteriano y gas en la campana.
8- Reincubar aquellos tubos que no muestran esos cambios y reexaminar luego de otras 24hs.


Ensayo confirmativo
9- Someter a la prueba confirmativa todos los tubos que a las 24 ó 48 h presenten reacción
positiva presuntiva. Si esta reacción positiva aparece a las 24 h, es conveniente pasar a la
confirmación sin dejar transcurrir las 48 h
1.10- Agitar suavemente los tubos.
1.11- Subcultivar por medio de un ansa de cada tubo con resultado positivo presuntivo a un tubo
con medio caldo lactosa bilis verde brillante (CLBVB) con campana de Durham. Rotular todos
los tubos adecuadamente.
1.12- Incubar los tubos de CLBVB por 48 ± 3 h a 35 ± 0 sC.
1.13- La producción de gas constituye un resultado positivo confirmado.
1.14- Calcular el valor de NMP de coliformes totales confirmados a partir del número de tubos
positivos del medio CLBVB.

2- Ensayo de coliformes fecales
2.1- Subcultivar con un ansa de cada tubo positivo presuntivode coliformes totales a un tubo con caldo EC con campana de Durham. Rotular adecuadamente los tubos de caldo EC.
2.2- Incubar en bañode agua a 44.5 ± 0.2 a°C por 24 ± 2 h
2.3- Considerar tubos positivos a los que presentan crecimiento y producción de gas a las 24h.
2.4- Calcular el valor de NMP de coliformes fecales a partir del número de tubos positivos del medio EC.

Recuento de Staphilococcus Aureus
3.1- Colocar en una gradilla nueve tubos con medio MSA (sin agar), para hacer la serie3-3-3.
3.2- Agitar vigorosamente la muestra para homogeneizar la suspensión.
3.3- Pipetear 1ml de la muestra y diluir en 9ml de SF dilución (-2).
3.4- Sembrar 1ml de la dilución (-1) en la primera serie de tubos, 1ml de la dilución (-2) en la segunda serie de tubos y 0.1ml de la dilución (-2) en la tercera serie de tubos. Rotular adecuadamente de forma de identificar el tubo con la dilución sembrada.
3.5- Mezclar cada uno de los tubos por agitación suave.
3.6-Incubar los tubos a 35a°C. Luego de 24 ± 2 h agitar los tubos suavemente y observar.
Considerar tubos positivos presuntivos a los que presentan turbidez debida al crecimiento bacteriano.
7- Reincubar aquellos tubos que no muestran esos cambios y reexaminar luego de otras 24hs.
8- Aplicar método de NMP.
9- Aislar a medio selectivo MSA durante 24h a 35a°C.
3.10-Si se vieron colonias típicas reaislar a medio no selectivo para obtener cultivo puro y poder realizarle las pruebas de identificación correspondiente a los efectos de confirmar el m.o


Descripción de colonias típicas de Staphylococcus aureus
|MSA |Colonias amarillas rodeadas de un halo amarillo |
|Baird-Parker Agar |Colonias negras, brillantes rodeadas de un halo claro |


Pruebas para Staphylococcus aureus
Coloración de Gram: cocos positivos en racimos
Fermentación de manitol: positiva
Catalasa: positiva
Coagulasa o DNAsa: positiva

Recuento de hongos y levaduras
4.1- Colocar en unagradilla nueve tubos con medio Agua de Malta, para hacer la serie 3-3-
4.2- Agitar vigorosamente la muestra para homogeneizar la suspensión.
4.3- Pipetear 1ml de la muestra y diluir en 9ml de SF dilución (-2).
4.4- Sembrar 1ml de la dilución (-1) en la primera serie de tubos, 1ml de la dilución (-2) en la segunda serie de tubos y 0.1ml de la dilución (-2) en la tercera serie de tubos. Rotular adecuadamente de forma de identificar el tubo con la dilución sembrada.
4.5- Mezclar cada uno de los tubos por agitación suave.
4.6-Incubar los tubos a 25a°C. Luego de 5 días agitar los tubos suavemente y observar.
Considerar tubos positivos presuntivos a los que presentan turbidez debida al crecimiento bacteriano.
7- Reincubar aquellos tubos que no muestran esos cambios y reexaminar luego de otras 48hs.
8- Aplicar método de NMP.
9- Aislar a medio selectivo SDA durante 5 a 7 días a 25a°C.
4.10- Si se vieron colonias típicas o morfología típica de hongos reaislar a medio no selectivo para obtener cultivo puro y poder realizarle las pruebas de identificación correspondiente a los efectos de confirmar el m.o

BÚSQUEDAS
Búsqueda de Salmonella
1- Pesar asépticamente 25 g de la muestra y diluir en 225 mL de medio TSB.
2- Incubar a 35sC durante 24 hs.
3- Pipetear 0,1 ml del TSB previamente incubado a un tubo con 10 ml de caldo Rappaport-
Vassiliadis y 1 ml a un tubo con 10 ml de caldo Tetrationato.
4- Incubar el caldo Rappaport a 41 sC por no más de 24 hs y el caldo Tetrationato a 35sC por 24 hs.
5- Deambos tubos realizar reaislamiento en Agar VB y Agar XLD.
6- Incubar las placas a 35sC por 24 a 48 hs.
7- Examinar el desarrollo de colonias típicas.
8- Si no existen colonias típicas, se informa ausencia de Salmonella sp en 25 g de muestra.
Si existen colonias típicas, reaislar algunas en medio TSA. Luego tomar colonias de este
medio y realizarles Gram, oxidasa, catalasa, TSI, Lisina de Moeller (o LIA) y ureasa (o
fenilalanina).




|MEDIO |DESCRIPCIÓN DE COLONIAS |
|Agar Xilosa Lisina Desoxicolato |Colonias rojas con o sin centro negro |
|Agar Verde Brillante |Colonias blancas o rosadas, pequeñas, transparentes, con halo |
| |rojizo |



PRUEBAS PARA SALMONELLA SP:
Coloración de Gram: bacilos negativos cortos o cocobacilos
Oxidasa: negativa
Catalasa: positiva
TSI: alcalino/ácido con o sin producción de H2S, con o sin gas
Ureasa y fenilalanina: negativa
Lisina Moeller: positiva
LIA: alcalino/alcalino con o sin producción de H2S



Búsqueda de Listeria monocytogenes

1- Pesar asépticamente 25g de muestra y agregar 225ml de medio EB. Agitar.

2- Incubar 30sC durante 48hs

3- A las 24hs de incubación realizar un aislamiento enmedio MMA. Incubar a 35sC durante 48hs.

4- Luego de trascurridas las 48hs de incubación aislar en medio LPM. Incubar a 35sC durante 48hs.

5- Si no existen colonias típicas, se informa ausencia de Listeria monocytogenes en 25 g de muestra. Si existen colonias típicas (observadas por transluminación) realizar un re-aislamiento en medio TSA-YE de los cultivos en MMA y LMP. Incubar a 30sC durante 24hs.

6- Realizar pruebas bioquímicas para la identificación del microorganismo.



Colonias típicas de Listeria monocytogenes

|Medio |Descripción de colonias típicas |
|LMP |Colonias bajo transluminación de color gris a azulado con fondo de apariencia brillosa. |
|MMA |Colonias observadas por transluminación con aspecto azulado y granular. Pequeñas (menor a 1mm). |
|(Agar MacBride Modificado) | |


Pruebas Bioquímicas para Listeria monocytogenes:
Beta hemolisis +
Tumbling Motility +
cAMP S.Aureus +
cAMP Rhodococcus -
Umbrella motility +
Gram +
Catalasa +
Oxidasa -
Urea -
TSI a/a
Glucosa O/F +/+
MR VP +/+
NO2 -
Manitol -
Xylosa -
Rhamnosa +

NOTA: Se puede realizar un pre-enriquecimiento en medio no selectivo (TSB-YE, 30sC-24hs) para reparar bacterias de Listeria lesionadas, y luego sembrar en el medio selectivo EB (30sC-24HS).