Métodos para el analisis de
proteínas
1. Cuantificación de proteínas
totales. 2. Técnicas de separación de proteínas. Analisis de proteínas específicas.
INTRODUCCIÓN A lo largo de este tema vamos a
estudiar las distintas técnicas que nos permiten analizar desde un punto
de vista cuali y cuantitativo, el contenido proteico de las muestras
biológicas haciendo especial hincapié en el estudio de las
proteínas plasmaticas. Las proteínas estan
presentes en todas las células y en los distintos líquidos
corporales: suero o plasma (66-83g/L), orina (100-200 mg/L), líquido
cefalorraquídeo (15-45 mg/dL). Si nos centramos en las proteínas
plasmaticas, podemos diferenciar: • Proteínas
plasma-específicas: componentes habituales del plasma. •
Proteínas no plasma-específicas: aquellas que aparecen en el
plasma por rotura de otras células. Las proteínas
plasma-específicas (albúmina + globulinas) se sintetizan
fundamentalmente en el hígado, pero también en: células
plasmaticas, ganglios linfaticos, bazo y médula
ósea. En caso de enfermedad, tanto la concentración total como
la de las distintas fracciones pueden verse alteradas. Así, la
determinación de las proteínas totales sirve para el
diagnóstico de: • Afecciones hepaticas • Afecciones
de la médula ósea • Otras afecciones del metabolismo o
nutricionales 1. Cuantificación de proteínas totales Los
principales métodos empleados para la determinación de
proteínas totales son los siguientes: • Método del Biuret
En solución alcalina el Cu+2 reacciona con el enlacepeptídico de
las proteínas dando un color purpúreo que se cuantifica
espectrofotométricamente (540nm). Como
estandar se utiliza una solución de albúmina.
Proteína + Cu+2 Complejo Cu-Proteína (púrpura
Muestra: suero o plasma (heparina o EDTA). Separar el suero del coagulo
o el plasma de las células antes de 3h. Si el paciente esta
acostado durante la extracción el resultado
sera menor. • Método de Lowry Dependen de la
concentración de tirosina y triptófano de la muestra. Consiste en
dos reacciones: 1. Reacción de Biuret
2. Reacción de Folin: característica de los grupos –OH
reductores de los aminoacidos tirosina y triptófano que, junto
con los complejos Cu+ reducen el reactivo de Folin
generando un color azul. Esta sujeto a muchas
interferencias. Se utiliza fundamentalmente en orina.
• Turbidimetría Medición de la turbidez
resultante de la precipitación de proteínas •
Absorción en el ultravioleta Se mide la absorbancia a 270nm originada
fundamentalmente por los anillos aromaticos de triptófano y
tirosina. • Métodos de unión a colorantes NOTA: para
semicuantificar la concentración de proteínas en orina se
utilizan tiras reactivas. 2. Técnicas de separación y
analisis de las proteínas La proporción de las fracciones
proteicas individuales cambia en el transcurso de un
gran número de enfermedades lo que conlleva que, la
cuantificación de las mismas sea de valor considerable en el
diagnóstico clínico. Los procedimientos mas utilizados
actualmente en el laboratorio clínico para el estudio de
lasproteínas son los siguientes: 1. 2. 4. 5. 6. 7. Turbidimetría y
nefelometría Inmunodifusión Electroforesis Inmunoelectroforesis
Inmunoelectroforesis en cohete Inmunofijación Cromatografía
1 TURBIDIMETRÍA Y NEFELOMETRÍA Cuando
un haz de luz choca con una partícula en suspensión parte de la
luz se dispersa, parte de la luz se refleja y parte de la luz se absorbe. La
dispersión de la luz depende de: la longitud de
onda de la luz (?), del tamaño de la
partícula y del
índice de refracción de la partícula en relación
con el medio que la rodea. La dispersión de la luz
se puede medir por turbidimetría o por nefelometría. En ambas
técnicas, para dar como resultado una
concentración de proteína concreta, se compara la cantidad de luz
dispersada o la tasa de aumento de dispersión con los valores de dichos
parametros en estandares proteicos conocidos.
1.1.
La turbidimetría mide la disminución de la luz
transmitida a través de una suspensión de partículas
utilizando para ello un espectrofotómetro (detector en la misma
dirección del
haz de luz, se mide A o T). Se suele utilizar para soluciones concentradas
(para que haya una buena disminución de la luz
transmitida) ej. determinación de
proteínas totales en suero, LCR u orina (haciendo que las
proteínas precipiten con TCA o acido sulfosalicílico).
1.2
La nefelometría: mide la luz dispersada en dirección distinta a
la luz emitida (generalmente con angulos que oscilan entre 15 y
90º). Utiliza como
instrumento el nefelómetro (en el que el detector se ubicacon un
angulo que oscila entre 15 y 90º ej. a 90º). Se suele utilizar para concentraciones mas diluidas.
Aspectos practicos: • Tanto en los reactivos como en el suero
pueden existir partículas que produzcan una dispersión de luz no
deseada ej. lipoproteínas, quilomicrones
También puede interferir la suciedad. • La intensidad de la luz
dispersada aumenta al disminuir la ?. Las
proteínas suelen tener un pico de absorción en el ultravioleta ( < ? 300nm) y los cromógenos del suero entre 400-425nm; por todo ello se
suele trabajar a ? que oscilen entre 320-380nm y
500-600nm. Muy frecuentemente, para cuantificar proteínas concretas, se
utilizan anticuerpos que reaccionan con dichas proteínas de la muestra,
en este caso se habla de inmunoturbidimetría e
inmunonefelometría. Para enteder estas
técnicas necesitamos tener claro unos conceptos previos: •
Antígenos (Ag): sustancias, generalmente de gran tamaño, capaces
de estimular el sistema inmunológico de un
animal y originar una respuesta dirigida específicamente contra
él.
Epítopo o determinante antigénico: lugar del antígeno
que reconoce y se une al anticuerpo. Anticuerpo (Ac): grupo de proteínas
llamadas inmunoglobulinas, producidas por linfocitos B y su progenie
(células plasmaticas) que se combinan específicamente con
los antígenos.
Cuando se ponen en contacto un Ag y un Ac específico contra ese
antígeno ambos reaccionan y forman un complejo Ag-Ac. Inicialmente los
complejos se forman rapidamente pero, existe una segunda fase de
crecimiento decomplejos mas lenta y, es precisamente en ésta fase
en la que aparece la dispersión de la luz. Así, en la
inmunoturbidimetría e inmunonefelometría se mide la
dispersión de la luz provocada por los
compeljos Ag-Ac. En ocasiones los Ac se unen a bolitas de latex para
aumentar el tamaño de los complejos (inmunoanalisis potenciados).
INMUNODIFUSIÓN La inmunodifusión se
basa en la formación de bandas de precipitación Ag-Ac en medios
semisólidos (generalmente de agarosa). La formación de
inmunocomplejos se ve afectada por variables como: pH, temperatura, fuerza
iónica del medio, características propias del Ac como afinidad y
avidez y, la mas importante, la concentración relativa de Ag y
Ac. La zona óptima de concentración para la formación del
precipitado Ag-Ac se llama zona de equivalencia. La inmunodifusión puede
ser simple (sólo se mueve el Ag o el Ac) o doble (se mueven Ag y Ac). Para visualizar el resultado de la inmunodifusión,
una vez terminada la difusión se lava el gel y se tiñe con
colorantes para proteínas (ej. negro amido o
azul brillante de Coomassie). La inmunodifusión se puede clasificar
atendiendo a distintos criterios. Entre otras modalidades podemos hablar de: a)
Inmunodifusión radial: en este caso se añade un antisuero
específico a la agarosa que, a su vez , se
vierte sobre placas. Se forman pozos en el gel y se colocan
en ellos estandares d e proteínas y problemas (antígenos).
El antígeno difunde en el gel durante varias horas y va reaccionando con
el Ac. Em la zona de equivalencia se produceun anillo de precipitación
a) Inmunodifusión doble o técnica de Ouchterlony: se forman pozos
en el gel de agarosa, generalmente en patrón de roseta. Se depositan antisueros específicos en los pozos centrales y
los estandares de proteínas y los problemas en los pozos
circundantes. Al difundir las muestras en el gel,
donde el anticuerpo y el antígeno alcanzan la equivalencia, se forman
bandas de precipitados insolubles. La posición y forma de la
banda se determinan según la concentración del antígeno y del anticuerpo, y sus tamaños. La
distancia de las bandas con respecto al anticuerpo es directamente proporcional
a la cantidad de antígeno presente.
Inconvenientes de la inmunodifusión: 1. Es necesario que las
concentraciones de Ag y Ac sean similares o de lo
contrario no se alcanza la equivalencia y no se forma el precipitado. El
precipitado solo se forma en el punto de equivalencia o cuando hay un ligero exceso de Ag. 2. Las moléculas mas
pequeñas migran con mas rapidez que las de gran tamaño y
conforme la migración continúa el precipitado puede redisolverse
y volverse a formar de acuerdo con los cambios de concentración de Ag o
Ac en el gel. Si hay grandes
cantidades de Ac, el antígeno no se difunde muy lejos antes de alcanzar
la equivalencia y el anillo es mas grueso o espeso. ELECTROFORESIS Una de las técnicas
mas sencillas para la separación (y posterior
cuantificación) de proteínas es la electroforesis (técnica
en la cual una partícula cargada se hace desplazar a través de un medioaplicando un campo eléctrico). Cuando se
aplica un campo eléctrico a un medio que
contiene partículas cargadas, las partículas cargadas
negativamente migran hacia el anodo o polo positivo mientras que, las
cargadas positivamente migran hacia el electrodo negativo (catodo). Este
principio se puede aplicar para separar las fracciones de proteínas
puesto que los aminoacidos (aa) constituyentes de la proteínas, y
por tanto las proteínas, son compuestos anfóteros que se comportan
como acidos
(ceden protones y quedan con carga negativa) o bases (captan protones y quedan
con carga positiva) dependiendo del medio en el que estén.
NOTA: El pH al que un aa no se comporta ni como acido ni como
base se
denomina punto isoeléctrico pI (en él la estructura del aa no posee carga
neta). Los pI varían desde 3 a 10, sin que exista un
pH al que todos los aa sean neutros.
• • a pH superior 2 o + unidades a pI, el aa aparece cargado
negativamente a pH inferior 2 o + unidades a pI el aminoacido aparece
cargado positivamente pH = pI los aa aparecen como
iones dipolares neutros
• En soluciones muy acidas todos los aa aparecen como cationes, mientras que en soluciones muy
basicas los aa se encuentran en forma aniónica
Si una disolución de proteínas se somete a la acción de un
campo eléctrico la tasa de migración durante la electroforesis
depende de: • • • La carga neta de la molécula, su
forma y tamaño La fuerza del campo eléctrico
Características del soporte
La cantidad de carga neta en la molécula es variable ydepende del pH del
amortiguador. Si el pH del
medio es menor que el punto isoeléctrico, las proteínas se compo
rtan como cationes y, si el pH del
medio es superior al pI, se comportan como
aniones. La carga de la proteína se hace mas negativa a medida
que el pH del
amortiguador se hace mas basico. A pH 8
(basico) todas las proteínas migran hacia el anodo (tienen
carga global negativa). La albúmina, con pI de 4
tendra una mayor carga negativa que la gamma-globulina, que tiene un pI
de 7,2. En definitiva, lo anterior explica que la albúmina recorra una
mayor distancia que la gamma-globulina cuando se sitúen en un campo eléctrico. Hay numerosos
sistemas de electroforesis de proteínas comercialmente disponibles.
En clínica el suero es la muestra de elección.
Se puede usar plasma pero, en ese caso se
observara una banda adicional de fibrinógeno. También
se puede analizar orina y líquido cefalorraquídeo si se aumenta
su contenido proteico (hasta 20-30 g/l) por ultracentrifugación,
dialisis u otras técnicas de concentración. Los
pasos a seguir en una electroforesis se pueden resumir en
1. Separación electroforética mediante un campo eléctrico
2. Fijación de las proteínas sobre el soporte Revelado de las proteínas
para identificar su presencia y separación. Se realiza mediante
colorantes acidos, negro amido, rojo Ponceau
que se fijan sobre las funciones basicas de las proteínas. El
exceso de colorante se arrastra con mezclas acético -agua, o
metanol-acético, según el colorante utilizado con tal de que sedecolore el soporte sin elución del colorante fijado a
las proteínas. 4. Cuantificación de las fracciones
electroforéticas mediante fotómetros especiales
(densitómetros) que permiten cuantificar el colorante fijado a
diferentes distancias del
punto de aplicación, y con ello la representación grafica
de la separación (proteinograma: grafica que representa las
fracciones proteícas del
suero sanguíneo).
Cuando el soporte utilizado para llevar a cabo el desarrollo
electroforético es de “acetato de celulosa” las principales
fracciones proteícas son
• •
La fracción de albúmina (aprox. 64.5%): la que mas migra
respecto al punto de aplicación de la muestra (catodo) Las
globulinas que se subdividen en las siguientes fracciones: alfa 1 (a-1
globulinas, aprox. 6%), alfa 2 (a-2 globulinas, aprox. 6.5%), beta
(ß-globulinas, aprox. 12.6%), y gamma (? globulinas, inmunoglobulinas o
anticuerpos, aprox. 7.9%, es la banda que menos se desplaza y en sueros no
patológicos es la banda mas ancha).
El fibrinógeno aparece entre las ß y ? globulinas cuando la muestra utilizada es plasma no
así en el suero (se ha co nsumido en la coagulación). Cuando el
soporte es gel de agarosa las ß-globulinas, se dividen en: ß-1 y
ß-2. Es muy importante tener en cuenta que cada fracción
esta formada por un conjunto de
proteínas con una movilidad electroforética semejante aunque muy
distintas en cuanto a su estructura y función. Ademas, excepto la
albúmina, el resto de las fracciones corresponden a grupos de
proteínas, por ello ,aunque el resultado de la fracción sea
normal, puede existir variación porcentual en sus componentes. Conviene
corroborar los resultados del
proteinograma con ensayos inmunológicos mas específicos como la
inmunodifusión radial o la inmunoelectroforesis.
4. INMUNOELECTROFORESIS La inmunoelectroforesis es una inmunodifusión en
la que se aplica una corriente eléctrica para separar las
proteínas de la muestra. Esta técnica se realiza en dos fases:
• • Electroforesis para separar las proteínas de la muestra
en función de su carga. Aplicación de un
antisuero, mono o poliespecífico, en un surco paralelo a la
dirección del
campo eléctrico. El o los anticuerpos
difunden durante 18-24h. Si se produce el
reconocimiento Ag-Ac se forman bandas de precipitación.
Se utiliza fundamentalm ente para analizar, cualitativamente,
alteraciones de distintas proteínas, especialmente inmunoglobulinas en
suero, orina o líquido cefalorraquídeo. 5.
INMUNOELECTROFORESIS EN COHETE La inmunoelectroforesis en cohete es una
técnica cuantitativa equivalente a la inmunodifusión radial pero,
a en la que la placa se expone a un campo
eléctrico. Al igual que en la inmunodifusión
radial, el antisuero (Ac) se incorpora al gel de manera que el Ac no pueda
migrar. En el gel se realizan unos pocillos (generalmente en el
catodo) que se rellenaran con la muestra o con diluciones
patrón. Una vez depositadas éstas se activa el
campo eléctrico. El Ag se desplaza en la agarosa y precipita al
encontrarse con el Ac. La precipitación vaproduciéndose a medida
que el Ag avanza hacia el anodo de manera que al ir disminuyendo la
concentración de Ag los bordes laterales se van acercando hasta unirse.
Así, se produce una precipitación triangular (en estela de cohete). La concentración de Ag de la
muestra es directamente proporcional al area y altura del
triangulo. Comparando los resultados de la muestra con los obtenidos en
las diluciones patrón obtendremos un resultado
cuantitativo.
INMUNOFIJACIÓN La inmunofijación
consiste en la separación electroforética de las proteínas
de una muestra seguida del
contacto del
gel con una tira de acetato de celulosa impregnada con antisuero. La
unión Ag-Ac da lugar a la formación de bandas de
precipitación visulalizadas tras lavar y teñir. Es una técnica muy rapida que se utiliza
especialmente en le detección de bandas oligoclonales en líquido
cefalorraquídeo. Preguntas de revisión
1. Si pretendiera cuantificar la concentración
de proteínas en una muestra de suero ¿Qué método
emplearía? 2. 4.
Describa el fundamento del método anterior
¿Sabría idear un protocolo experimental para llevar a cabo dicho
método? ¿Sería necesario preparar
algún blanco? Razone su respuesta
5. Un paciente con un mieloma: a)
¿Tendría hiper o hipoproteinemia? b) Si quisiera identificar la
inmunoglobulina que aparece alterada ¿qué técnica
podría utilizar? c) ¿Y si quisiera cuantificarla? 6.
¿Podría utilizar la espectrofotometría con luz U.V. para cuantificar proteínas? Conteste razonadamente. 7. a) b) c)
d) e) 8. a) b) c) d) e) 9. a)b)
c) d) e) 10. a) b) c) La nefelometría difiere de la turbidimetría
en: Mide el índice de refracción Angulo de medida de la
luz dispersa Tiene menor sensibilidad Se pueden medir partículas de bajo
peso molecular La solución no necesita ser homogénea La La La La
La La La La La La La La nefelometría mide: luz dispersada luz
transmitida disminución de la luz transmitida disminución de la
luz dispersada luz reflejada turbidimetría mide luz dispersada luz
transmitida disminución de la luz transmitida disminución de la
luz dispersada luz reflejada
Conteste razonadamente verdadero o falso a las siguientes afirmaciones de las
medidas nefelométricas Su principal aplicación es en la medida de
reacciones Ag-Ac Trabajan con medidas en distintas zonas del espectro. Se hacen
en angulos de 15 a 90º respecto a la luz incidente.
a) b) c) d) e) 12. a) b) c) d) e) 1 a) b) c) d) e) 14. a)
b) c)
La turbidimetría se puede medir: En turbidímetros especiales. En
aparatos con un monocromador de turbidez. En aparatos
con un detector especial para la luz dispersa. En cualquier espectrofotómetro o analizador de
química clínica. En aparatos con cubetas especiales El
angulo de medida de la luz dispersa en turbidimetría es: 0o 10o
15 a 90o 90o Cualquiera El angulo de medida de la luz dispersa en
nefelometría es: 0º 10º 15 a 90º 90º Cualquiera La
longitud de onda que se emplea en las medidas de luz dispersa: Debe ser tal que
no se absorba luz por los componentes del suero. Debe ser lo
menor posible Deber ser lo mayorposible
15. La inmunodifusión radial es una técnica cuantitativa
¿Por qué? 16 ¿Cual cree
que es el principal inconveniente de las técnicas inmunológicas? a) Es necesario que las concentraciones de Ag y Ac se encuentren
dentro de la zona de equivalencia b) Son téc nicas poco sensibles c) Son
técnicas poco específicas 17. La inmunodifusión
doble es una técnica cualitativa o semicuantitativa ¿por
qué? 18. En un campo eléctrico, una molécula cargada
negativamente migra hacia el: a) Anodo b) Catodo c) Polo negativo
d) Polo positivo e) a y d 19. ¿Qué factores afectan a la
movilidad de una partícula en el seno de un
campo eléctrico) a) pH del
tampón b) Fuerza iónica del
tampón. a) Tamaño y forma de la partícula. b) Potencial del
campo. c) Todos 20. El punto isoeléctrico es: a) El pH al cual una
partícula no se mueve b) El pH al cual una partícula migra al
anodo c) El pH al que la carga neta de la partícula es cero. d) ayc
e)
ay b
21. ¿Cual es el medio de soporte mas
empleado en electroforesis? 22. ¿Cual es el método
de elección para la lectura de un espectro
electroforético? a) Nefelometría b) Turbidimetría c)
Elusión d) Fotodensitometría 2 Hemos sometido una muestra de
suero a una separación electroforética, a pH 8,6, sobre acetato
de celulosa a) ¿Qué componentes se nos han separado en el
proceso? b) ¿A qué cambios en el proceso recurriremos
según queramos cuantificar proteínas o lipoproteínas? 24.
¿Sería conveniente llevar a cabo la electroforesis de
proteínas a pH 6? ¿ Por qué?
