Electroforesis

Técnica que describe la separación en un campo eléctrico de bio-moléculas al migrar a través de un medio de soporte (geles de agarosa o poliacrilamida para ácidos nucleicos), lo cual depende de su carga eléctrica, forma y tamaño.

Geles de poliacrilamida (PA
Forma geles transparentes con estabilidad mecánica, insolubles en agua, que permiten buena visualización de las bandas durante un tiempo prolongado; variando la concentración de polímeros, se puede modificar de manera controlada en el tamaño del poro, aunque cada vez se emplea menos en diagnóstico por su neurotoxocidad.
Geles de agarosa
La agarosa es un polisacárido (originalmente obtenido de algas, como el agar-agar, pero de composición homogénea), cuyas disoluciones (~0.5 a 2 %) poseen la propiedad de permanecer liquidas por encima de 50s C y formar un gel semisólido al enfriarse. Este gel está constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras poliméricas embebida en gran cantidad de medio líquido, que retarda el paso de las moléculas.

Fuentes de error en la electroforesis
Es una técnica muy sensible que puede ser afectada por muchos errores experimentales, como la temperatura durante la polimerización y la corrida del gel, la velocidad de la polimerización, niveles de catalizador, pureza del reactivo,  tiempo de corrida y preparación de las muestras.

TINCION DEL ADN DESPUES DE LA ELECTROFORESIS

Bromuro de etidio
Lafluorescencia en esta tinción es inducida por la luz ultravioleta que pasa a través del bromuro de etidio, ya que es una molécula planar que se intercala entre las bases apiladas de DNA, su posición estable y su proximidad a las bases favorece un incremento en la fluorescencia. Puede utilizarse para detectar cadenas dobles y sencillas de DNA y RNA.

Nitrato de plata
Solo se aplica a geles de poliacrilamida (PA), y se divide en los siguientes pasos: fijación, tinción con plata, enjuague del exceso de plata, revelado y secado. La solución fijadora ayuda a que el DNA se fije al gel de PA. Al aplicar la plata, la carga positiva de sus iones de plata le permiten unirse al DNA, y su reducción posterior con la solución reveladora cambia su color formando de bandas en el gel. Su principal ventaja es su sensibilidad, hasta 100 veces mayor que el bromuro de etidio.
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Las enzimas de restricción, también conocidas como endonucleasas, son enzimas que cortan los enlaces fosfodiester.



Son extraídas de organismos procarióticos (bacterias), donde actúan como un mecanismo de defensa, para degradar material genético extraño que entre en la célula.

Nomenclatura
a–  se nombran a partir de las bacterias de las que son extraídas, su nombre está dado según el género y la especie de la bacteria de donde se aisló por primera vez esta enzima.
a–  La primera letra representa el género de la bacteria, las próximas dos indican laespecie, una cuarta letra indica la cepa, y un número al final indica la cantidad de enzimas que se han aislado de esa cepa. Ej:
 
Eco RI ( E = género Escherichia
co = especie coli
R = cepa RV 13
I = primera endonucleasa aislada de esta cepa

Existen 3 tipos:
Tipo I y Tipo III
a–  Tienen actividad de restricción (cortan) y modificación (metilan) por una enzima metiltransferasa que transfiere grupos metilo desde S-adenosilmetionina a bases específicas (A, G C o T)
a–  Cortan a cierta distancia de la secuencia de reconocimiento, ya sea río arriba o río abajo. Las Tipo I cortan lejos de la secuencia de reconocimiento, y las Tipo III cortan de 5-8 bases antes o después de la secuencia que reconocen
a–  Necesitan ATP para moverse a través de la molécula de DNA, desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio del corte.
Tipo II
a–  Sólo tienen actividad de restricción
a–  Cortan de manera consistente y predecible dentro de una secuencia palindrómica (se lee igual al derecho y al revés) que reconocen.
a–  Sólo requieren Mg++ como cofactor.
a–  No necesitan ATP.
a–  Las enzimas tipo II, dependiendo de su especificidad, al romper el ADN provocan 2 tipos de cortes: Cortes pegajosos, dejando productos con extremos complementarios (cohesivos) porque tienden a aparearse o hibridarse nuevamente con otro extremo cortado con la misma enzima (Figura de arriba). CortesROMOS, cortan la misma posición en ambas cadenas del ADN
TRANSFERENCIA DE SOUTHERN, NORTHERN Y WESTERN

SOUTHERN BLOT
Definición.
Hibridación de una cadena sencilla de ácido nucleico (DNA o RNA) con fragmentos de DNA inmovilizados en un filtro. Fue la primera técnica de este tipo; el apellido de su descubridor es Southern, y las otras técnicas siguieron ese modelo de denominación. Edward Southern desarrollo la utilización de segmentos de DNA clonado, separados por electroforesis, transferidos a filtros, y rastreados con sondas.
Procedimiento.
1. Preparación de la muestra de DNA.
2. El DNA se corta (digestión enzimática) por acción de las enzimas de restricción.
3. Por electroforesis el DNA se desnaturaliza.
4. Se hace la transferencia del DNA que esta en gel, a la membrana de nitrocelulosa o nylon.
5. Se somete a hibridación de las sondas (fragmentos complementarios al DNA de interés) con el DNA que esta en la membrana, en ciertas condiciones fisicoquímicas y de temperatura.
6. Se aplica la Autorradiografía, cubriendo el filtro con una película de rayos x después se revela y se observa la secuencia complementaria.
Usos
Identificación de fragmentos de DNA que contiene determinado gen para diagnósticar enfermedades genéticas humanas
Identificación de genes relacionados en diferentes especies
Para detectar reorganizaciones y duplicaciones en genes asociados a cánceres.

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NORTHERN BLOT
Definición.Hibridación de una cadena sencilla de ácido nucleico (DNA o RNA) con un fragmento de RNA inmovilizado en un filtro. Esta técnica se utiliza para determinar si un gen clonado es transcripcionalmente activo en un tipo celular o en un tejido dado.
Procedimiento
1. El RNA es extraído y colocado en un gel de azarosa (NO HAY DIGESTION)
2. Por electroforesis se observa la separación de este.
3. Se hace la transferencia del RNA en gel a la membrana de nitrocelulosa o nailon.
4. Se somete a hibridación de sondas con el RNA que esta en la membrana, en ciertas condiciones fisicoquímicas y de temperatura.
5. Autorradiografía: Se cubre el filtro con una película de rayos x después se revela y se observa la secuencia complementaria.
Usos: Se utiliza para examinar patrones de expresión génica en células o tejidos.
Para detectar cortes empalmes altenartivos del mRNA, y/o múltiples tipos de transcritos provenientes de un solo gen.

WESTERN BLOT
Definición.
Detección de proteínas inmovilizadas sobre un filtro mediante la reacción complementaria con un anticuerpo específico. Las proteínas son separadas en primer lugar mediante electroforesis en geles de poliacrilamida y posteriormente se transfieren a una membrana. En este método se emplea un anticuerpo primario para localizar la proteína de interés. Un segundo anticuerpo marcado (fluorescencia, radioactividad, colorimetría, etc.) contra la especie en la que se ha producido el primero, se empleapara localizar donde se formaron los complejos antígeno-anticuerpo.
Procedimiento
1. La muestra es colocada en el gel de poliacrilamida generalmente donde se encuentran en este caso las proteínas del virus de VIH.
2. Electroforesis de poliacrilamida donde las proteínas migran según su carga, masa y forma por el gel.
3. Se transfiere el gel a la membrana de nylon que absorbe las proteínas ya separadas
4. Inmersión de la membrana de nitrocelulosa en una solución con anticuerpos donde los anticuerpos se vinculan de manera específica a las proteínas virales antigénicas(proteínas del VIH)
5. Así la 2S serie de anticuerpos se fija en la primera y se pone de relieve la enzima que tiene un receptor específico.
6. Las proteínas virales son separadas y coloreadas por anticuerpos marcados
7. Si la coloración aparece (la muestra amarilla y las corridas de la demás muestra verde) la prueba es seropositiva para el VIH
Usos
En 'Western blot' se emplea comúnmente el sistema de inmunodetección indirecta.
La técnica del Western blot tiene muchas aplicaciones en los laboratorios de investigación pero también ya ha sido transferida al diagnóstico de las enfermedades virales.
Para el caso de las infecciones con el virus HIV es una de las técnicas usuales para detectar la presencia de anticuerpos circulantes contra las proteínas del virus que es una indicación muy fuerte de que la persona se encuentra infectada por este virus.