RESUMEN
Usando técnicas establecidas para la reacción en cadena de la polimerasa, se amplificaron dos muestras de ADN, una genómica y una plasmídica, los fragmentos amplificado se analizaron en electroforesis en gel de agarosa revelando dos bandas de aproximadamente 600 pb, lo que nos permite concluir que las dos muestras poseen el mismo tamaño y al comparar con la muestra positiva, se ve que la amplificación fue correcta y no se contaminó.

INTRODUCCIÓN
La PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) es una técnica in vitro desarrollada en 1986 por Kary Mullis (1988) considerada hoy como imprescindible en el laboratorio ya que permitió el avance de la Biología Molecular e Ingeniería Genética (libro). Esta técnica permite sintetizar a gran velocidad muchas copias de DNA provenientes de un pequeño fragmento inicial de interés (Fig.1). En la PCR, el ADN se mezcla con una solución que contiene la DNA polimerasa, que debe ser termoestable, los desoxirribonucleótidos trifosfatos (dNTPs) y los cebadores, cadenas cortas de ADN diseñados para ligarse con los dos extremos del segmento estudiado.Existen dos puntos claves en la PCR. El primero es que permite amplificar el DNA. A partir de una muestra muy pequeña se pueden obtener grandes cantidades de DNA. El segundo es que la técnica es selectiva. Se puede comenzar con el genoma completo de un organismo, pero amplificar sólo la parte del DNA que codifica para un gen particular (Case 2007).

Fig.1. Copias de ADN sintetizadas en la PCR.
El proceso de la PCR consiste en una serie de 20 a 35 ciclos; cada ciclo suele consistir en 2-3 pasos llevados a cabo en temperaturas diferentes (Fig. 2). La PCR común se realiza con ciclos que tienen tres temperaturas. Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo varían según los compuestos usados. Éstos incluyen la enzima usada para la síntesis de ADN, la concentración de iones divalentes y de los dNTP en la reacción, y la temperatura de unión de los cebadores, así como la longitud del ADN que se desea amplificar (Sambroock 2010


Fig 2. Temperaturas de la PCR.



Para esta práctica se espera obtener y analizar los productos de la PCR por electroforesis en gel de agarosa de un fragmento de ADN genómico y uno plasmídico de bacteriassulfato-reductoras.

MATERIALES Y MÉTODOS
Preparación PCR
Inicialmente, antes de empezar la práctica, fue indispensable limpiar las superficies con Tego para evitar la contaminación por bacterias o sustancias presentes en el lugar de trabajo.
Luego se hicieron los cálculos para obtener la cantidad exacta de los componentes de la PCR (para 4 tubos).
Materiales
[STOCK]
*4 tubos
Buffer
5x
10µl
MgCl2
25Mm
8µl
dNTPs
10µM
2µl
Forward primer*
10µM
2.5µl
Reverse primer*
10µM
2.5µl
Taq polimerasa
5U
1µl
ADN
5µl
20 µl

H2O


54 µl
TOTAL

100µL
*Cebadores a usar.
Posteriormente, se montaron 3 tubos: negativo, ADN genómico y ADN plasmídico

Sin ADN ADN genómico ADN plasmídico


Inicio del proceso
Las soluciones anteriormente preparadas se centrifugaron a 12000 r.p.m. durante 4 minutos (sin agregar el ADN), se le agrego el ADN a cada tubo y se centrifugó de nuevo, seguidamente los tubos se ubicaron en el termociclador ( Fig.3.).

En el termociclador se programaron los ciclos de una PCR típica, que son aproximadamente 30. La temperatura se eleva hasta 92˚C para la desnaturalización, desciende hasta 55˚C para el alineamiento de los cebadores y vuelve a elevarse hasta 72˚C, que es la temperatura óptima para la Taq polimerasa, la cual lleva a cabo el proceso de extensión y elongación de la cadena de DNA.


Fig.3. Termociclador del CINBIN.



Finalmente se preparo un gel de agarosa teñido con Bromuro de Etidio para realizar la electroforesis en gel y luego de los ciclos, los productos obtenidos se depositaron en el gel donde también se deposito una muestra positiva para comparar con las preparadas.

RESULTADOS
M N G P Po

Productos de la PCR. M marcador; N corresponde al blanco, G ADN genómico, P ADN plasmídico y Po es la muestra positiva.

DISCUSIÓN
Con base enlos productos observados en el gel electroforético, podemos observar que las muestras si se amplificaron de forma correcta, en el segundo pozo no observamos nada ya que era la muestra que no contenía ADN, entonces nada se amplifico; pues a pesar que se tengan todos los componentes de la PCR, si no se agrega el ADN que actuará como “molde”, no

se va a obtener ningún resultado, los pozos 3 y 4 contenían ADN y gracias a la comparación con el marcador, puede que su peso sea de aproximadamente 600 bp, y vemos que ambos fragmentos poseen pesos similares, comparando con la muestra conocida (pozo 5) se ve que lo que se amplificó si es en realidad lo que se estaba esperando y no otro ADN proveniente de una fuente externa por contaminación de la muestra.

CONCLUSIONES
La PCR como técnica, es globalmente utilizada, esta tiene numerosas aplicaciones médicas, genéticas y en la investigación forense; la PCR permite obtener de manera rápida y relativamente fácil múltiples copias de un fragmento determinado de DNA que tras la amplificación resultan mucho fácil para identificar mediante electroforesis, como conclusión de la practica se observo una correcta amplificación que no fue contaminada por ADN externo, uno de los principales problemas de la técnica.

BIBLIOGRAFÍA
Case RJ, Boucher Y, Dahllöf J, Holmström C, Doolittle WF Kjelleberg. 2007. 'Use of 16S rRNA and rpoB genes as molecular markers for microbial ecology studies'. Appl. Environ. Microbiol. 73 (1): 278–88. doi:10.1128/AEM.01177-06. PMID 17071787. PMC 1797146.
Joseph Sambrook and David W. Russel (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed. edición). Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN 0-87969-576-5.
Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB.(1988) Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239: 487–491