PREPARACION DE FROTIS, TINCION SIMPLE, DIFERENCIAL Y DE ENDOESPORAS
OBJETIVO
Que el alumno aprenda las técnicas de preparación de frotis, de fijación y coloración mas utilizadas en el estudio microscópico de cultivos bacterianos, obtenidos de medios sólidos y líquidos. Que identifique las principales formas bacterianas y la importancia de las tinciones simples en la caracterización morfológica de estos microorganismos.
Que el estudiante clasifique algunas especies bacterianas en Gram positivas o Gram negativas de acuerdo a la tinción de Gram. Que observe estructuras bacterianas especiales, como las endosporas y capsulas con tinciones selectivas. Que comprenda la importancia que tienen estas tinciones para la caracterización e identificación de las bacterias.

INTRODUCCION
El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea, y el medio mas simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, capsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc.

Los microorganismos se pueden teñir satisfactoriamente mediante tinción simple, esto es, utilizando un solo colorante.
Los métodos de tincióndiferencial clasifican a las bacterias en grupos diferentes según sus propiedades de tinción.
Se han desarrollado numerosos métodos de tinción para estudiar estructuras bacterianas específicas con el microscopio óptico. Las endoesporas no se tiñen bien con la mayoría de los colorantes, pero una vez teñidas, resisten inmensamente la decoloración.
MUESTRAS:
Escherichia coli
Basillus subtilis
Micrococcus

MATERIAL:
1 mechero
1 asa de siembra
6 portaobjetos
Pizeta con agua destilada
EQUIPO:
Microscopio óptico
Parrilla de calentamiento
REACTIVOS:
Azul de metileno alcalino
Alcohol etílico al 70%
Fenol al 2%
Safranina
Lugol
Verde de malaquita
TECNICAS:
Tinción simple
Tinción diferencial de gram
Tinción Schaeffer-Fulton endospora
PROCEDIMIENTO:
TINCION SIMPLE:
1. Cubrir el frotis con 2 gotas de azul de metileno durante 30 segundos a 1 minuto.
2. Eliminar el exceso de colorante con lavado suave al agua corriente o con la ayuda de la piceta con agua destilada.
3. Dejar secaral aire
TINCION DIFERENCIAL
1. Marcar un portaobjetos con el nombre del microorganismo a observar. Cada equipo debera hacer obligatoriamente cinco preparaciones (una preparación por persona): una de E. coli, una de Bacillus sp., una de Serratia marcescens, una de Klebsiella pneumoniae y alguna de Pseudomonas.
2. Elaborar preparaciones fijas de las bacterias a observar.
3. Añadir 1 ó 2 gotas de cristal violeta a la preparación, hasta que se cubra por completo. Dejar actuar elcolorante durante 1 minuto.
4. Una vez transcurrido el tiempo, lavar la preparación con la pízeta sobre el recipiente de plastico para tinciones.
5. Agregar 1 ó 2 gotas de solución lugol a la preparación, y dejar actuar 1 minuto. Transcurrido el tiempo, lava.
6. Con cuidado, añadir gota a gota el alcohol-acetona lavando la preparación durante 10 segundos.
7. Añadir el colorante de contraste, safranina (1 ó 2 gotas) y dejar actuar durante 30 segundos. Lava con la pizeta.
8. Dejar secar al aire y observar al microscopio, siguiendo la técnica de la practica anterior para enfocar correctamente. Observar con el objetivo de inmersión.

TINCION ENDOESPORAS
Colocar un pequeño trozo de papel filtro sobre el frotis de Bacillus subtilk.
b) Agregar verde de malaquita sobre el papel filtro de tal manera que cubra toda la preparación.
c) Colocar el portaobjetos sobre un vaso de precipitados con agua en ebullición.
d) Dejar durante 5 minutos evitando que se seque el colorante (agregar un poco mas sí es necesario) y eliminar el colorante con agua destilada.
e) Cubrir con safranina durante 30 segundos.
f) Lavar nuevamente y dejar secar al aire.
RESULTADOS

TINCION SIMPLE

TINCION DE GRAM

TINCION DE ENDOESPORAS

OBSERVACIONES:
En la preparación del frotis se nos paso el tiempo de tenerlo cerca del mechero por lo tanto se quemaron los frotis en nuestro primer intento y no pudimos observar nada.
CONCLUCIONES
Observamos las tinciones con otros frotis preparadosde una manera mas adecuada y nos hizo distinguir cada una de las técnicas.
CUESTIONARIO
1. ¿Cuales son los dos propósitos de la fijación por calor?
a. conserva adecuadamente la morfología general
b. los fijadores químicos reaccionan con los componentes celulares para inactivarlos y convertirlos en inmóviles e insolubles.

2. ¿Cual es el propósito de la tinción simple?
Teñir satisfactoriamente los microorganismos con un solo colorante

3. ¿Por qué los colorantes basicos mas éxito en la tinción de las bacterias que los tintes acidos?
Porque las superficies de las células bacterianas estan cargadas negativamente.

4. Nombra tres colorantes basicos.
a. azul de metileno
b. fucsina basica
c. cristal violeta

5. ¿Por qué el tiempo es un factor importante en la tinción simple?
Porque si tarda poco no se tiñen las bacterias, y si dura mucho se colorea toda la muestra.

6. ¿Cual es la diferencia entre una mancha simple y diferencial?
En que la simple solo se utiliza un colorante y en la diferencial se utiliza mas de uno.

7. Nombre del reactivo utilizado y establecer el propósito de cada uno de los siguientes en la tinción de Gram
a. mordaz: solución yodada
b. tinción primaria: safranina
c. decolorante: solución acido alcohólica
d. contratinción: azul de metileno

8. ¿Cual paso es el mas importante o mas susceptibles de causar malos resultados en la tinción de Gram? ¿Por qué?
La tinción de acido alcohol resistente ya que no se une facilmente acolorantes simples, hay que teñirlas con un tratamiento mas fuerte.

9. ¿Por qué se utilizara cultivos jóvenes al realizar una tinción de Gram?
Porque en el analisis es importante la conservación de la muestra.

10. ¿Qué se entiende por variable gram?
Que pueden variar entre gran positivas y negativas.

11. ¿Qué parte de la célula bacteriana es mas involucrados con la tinción de Gram, y por qué?
La pared celular y esta se ve mas involucrada porque es la de primer contacto y tiene un alto contenido de lípidos.

12. ¿Por qué es el calor necesario para manchar endosporas?
Para permeabilizarlas y poder introducir el colorante dentro de la espora.

13. ¿Dónde estan ubicadas las endosporas dentro de las células vegetativas?
Cubriendo el ADN.

14. En la mancha Schaeffer-Fulton endospora, ¿cual es la principal mancha?
El verde de malaquita.

15. Nombre dos bacterias causantes de enfermedades que producen endosporas.
a.  Clostridium
b. bacillus

16. ¿Cual es la función de una endospora?
Su función es mantener viva a la bacteria bajo condiciones extremas protegiendo el ADN.

17. ¿Por qué son tan difíciles de manchar endoesporas?
Porque es difícil llegar a ellas y hacerlas permeables al colorante.

BIBLIOGRAFIA
Lansing M. Prescott, John P. Harley, Donald A. Klein. Microbiologia. Quinta edicion. Editorial Mc Graw Hill.
Michael T. Madigan, John M. Martinko, Jack Parker. Biologia de los microorganismos de Brock. 10 edicion. Editorial Pearson.