PRACTICA 1.
Observación de los fenómenos osmóticos en epidermis de cebolla.
Objetivo.

El objetivo de esta practica es visualizar los fenómenos osmóticos de turgencia y plasmólisis celular.

Introducción.
La célula vegetal adulta encierra una voluminosa vacuola separada del medio que la rodea por una membrana llamada tonoplasto. Ésta se comporta en primera aproximación como membrana semipermeable con respecto a numerosas sustancias disueltas, como por ejemplo, el cloruro sódico o la sacarosa.
La pared celular rígida limita la posibilidad de dilatación de la célula y, en consecuencia, la absorción de agua. Ello constituye, por otra parte, un marco gracias al cual, los cambios en el contenido hídrico son perceptibles directamente.

Material.

Hojas de cebolla
Colorante rojo neutro al 1% en tampón fosfato 0,1 M PH=7,4
Disolución de NaCl al 6%
Microscopio óptico
Pinzas

Manipulación.

Utilizando las pinzas y el bisturí, tomamos un fragmento de epidermis, de la parte interna del casco de la cebolla, aproximadamente 0,5 cm de lado.

Lo sumergimos durante un minuto en la disolución de rojo neutro al 1% solubilizado en tampón fosfato 0,1 M PH=7,4.


Colocamos el fragmento de epidermis en el porta, tapandolo con el cubre, eliminando el exceso de líquido succionandolo con papel de filtro y a continuación lo observamos en el microscopio.

Reemplazar el colorante, en la preparación, con disolución de NaCl al 6%, colocando unas gotas de esta disolución en elporta-objetos, junto a un borde del cubre, pero sin mancharlo y colocando un fragmento de papel de filtro en el lado opuesto, para aspirar por capilaridad el colorante.
La disolución de cloruro sódico ocupara el lugar de aquel, lo que se reconoce porque el líquido de la preparación se aclara. Repetir los lavados cuatro o cinco veces y observar inmediatamente la preparación al microscopio.

Cuestiones.
1. ¿A qué se debe la gran extensión de la coloración de la célula tras la tinción con rojo neutro?
Al sumergir la epidermis en la disolución de rojo neutro (medio hipotónico en relación al jugo vacuolar), el agua con el colorante, pasa al interior de la vacuola provocando el aumento de su volumen con lo que el tonoplasto queda adherido a la membrana plasmatica. El colorante difunde por todo el contenido vacuolar tiñéndolo en toda su extensión.
2. ¿Qué papel desempeñan las diferentes concentraciones de las disoluciones de tampón fosfato y de cloruro sódico sobre la del jugo vacuolar?
La disolución formada por el rojo neutro y el tampón fosfato es hipotónica con respecto al jugo vacuolar y produce el fenómeno de turgencia.
La disolución de NaCl al 6% es hipertónica en relación con el jugo vacuolar por lo que el agua sale de la vacuola y esta se contrae produciendose el fenómeno de plasmólisis.
3. ¿A qué atribuye los cambios que se observan en la vacuola en cada caso?
A los fenómenos osmóticos descritos en la pregunta anterior.

PRACTICA 2.
Observación y/o tinción de losgranos de almidón de la patata con Lugol.
Objetivo.

Observar granos de almidon de la patata y conocer la técnica de tinción con Lugol para el reconocimiento de la presencia de dicho polisacarido.

Introducción.

El Lugol es una disolución acuosa de yodo y yoduro potasico que sirve para averiguar si, en una disolución de azucares no reductores (reacción de Fehling negativa), existe el polisacarido almidón (prueba de Lugol positiva).

El almidon es un polisacarido mezcla de amilosa y amilopectina.

Cuando el almidón se pone en contacto con unas gotas de Lugol toma un color azul violeta característico (la amilosa se colorea de azul oscuro a negro y la amilopectina se colore entre naranja y amarillo)

Se trata de una reacción no química, en la que se forma un compuesto de inclusión del yodo en el interior de las hélices de la amilosa. Esta inclusión es reversible y esta condicionada por la temperatura.

Material.

Patata.
Microscopio óptico.
Reactivo de Lugol (yodo-yoduro potasico 1%)
Suspensión acuosa de almidón.

Manipulación.

Coger un trozo de patata, añadirle una gota en la superficie y hacer un raspado de tejido.

Se obtiene una suspensión de granos de almidón que enturbia la gota de agua, dandole color blanquecino.


Poner una gota de esta suspensión sobre el porta, colocar el cubre y observar al microscopio.
Poner una gota de esta suspensión sobre el porta, colocar el cubre y observar al microscopio.

Poner ahora una gota de reactivo yodo-yoduropotasico (1%) sobre el porta, en contacto con el borde del cubre, y con un papel de filtro en el borde opuesto, hacer que penetre en la preparación.


Observar de nuevo en el microscopio.

En caso de que no se disponga de microscopio:

Se puede hacer reaccionar la suspensión obtenida tras el raspado de la patata con una gota de reactivo yodo-yoduro potasico (1%), para observar el cambio de coloración.

Se colocan en un tubo de ensayo 3 ml de una suspensión acuosa de almidon, se le añaden 3 gotas de la solución de Lugol, se observara la aparición de color azul-violeta característico.


A continuación de calienta suavemente, sin que llegue a hervir, se observara que pierde el color. Posteriormente se enfría el tubo de ensayo con agua del grifo y, después de unos 2-3 minutos, reaparecera el color azul.

Cuestiones.

1. Conocer la forma de los granos de almidón obtenidos a partir de este material vegetal.

Los granulos de almidón de patata suelen ser de forma redondeada, pero también aparecen granulos de forma alargada o mas o menos irregular.

2. Relacionar el tamaño de los granos y el número de capas que se observan en ellos.

Comparados con los granulos de almidón de otras vacuolas, los de la patata estan entre los mas grandes.

En los granulos de almidón (no estan rodeados por ninguna envoltura), las moléculas de amilosa y de amilopectina se disponen en forma radial, formando una serie de capas concéntricas que rodean a una zona que recibe elnombre de hilo. Que puede estar en el centro del amiloplasto, posición céntrica o estar en un lateral posición excéntrica.

Estas capas son capas de crecimiento, por tanto cuanto mas numero de capas aparezcan en los mismos, mayor sera el tamaño de los granos.

3. Conocer la posibilidad de utilizar el reactivo yodo-yoduro potasico (1%) para detectar la presencia de almidón en un medio.

La reacción del Lugol es un método que se usa para identificar polisacaridos. 
El almidón en contacto con el reactivo de Lugol (disolución de yodo-yoduro potasico) toma un color azul-violeta característico. Esa coloración producida por el Lugol se debe a que el yodo se introduce entre las espiras de la molécula de almidón. Por lo tanto, no es una verdadera reacción química, sino que se forma un compuesto de inclusión que modifica las propiedades físicas de esta molécula, apareciendo la coloración azul violeta. Este complejo es sensible a la temperatura, ya que si se calienta el tubo, el color desaparece. Esto se debe a que las espiras del almidón se 'desarman', por así decirlo, y el yodo se libera. Una vez frío, las espiras se reorganizan y se vuelve a ver el color.


4. Fundamento de la reacción de color y de los cambios con la temperatura.

La coloración producida por el Lugol se debe a que el yodo se introduce entre las espiras de la molécula de almidón. 
No es por tanto, una verdadera reacción química, sino que se forma un compuesto de inclusión que modifica las propiedadesfísicas de esta molécula, apareciendo la coloración azul violeta.


PRACTICA 3.
Determinación del poder reductor de azúcares.
Objetivo.

Poner de manifiesto la presencia de azúcares reductores en un medio, mediante una reacción de color de tipo redox.

Introducción.

Los monosacaridos y la mayoría de los disacaridos poseen poder reductor, que deben al grupo carbonilo que tienen en su molécula.

El reactivo de Fehling es utilizado con el fin de poner de manifiesto la capacidad reductora de un azúcar. Consiste en una mezcla de dos reactivos: el Fehling A (sulfato
cúprico), de color azul, y el Fehling B (tartrato sódico-potasico), incoloro.
La reacción con el glúcido reductor (en caliente) da lugar a óxido de cobre (I) que forma
un precipitado de color rojo. De este modo, el cambio de color indica que se ha
producido una reacción de tipo redox y que, por tanto, el glúcido presente es reductor.

Material y Manipulación:

1ª parte
Poner, en distintos tubos de ensayo, 3 ml de solución acuosa de glucosa, fructosa, sacarosa y almidón.

Añadir en cada tubo 1 ml de solución de Fehling A (contiene CuSO4) y 1 ml de
Fehling B (tartrato sódico-potasico, para alcalinizar el medio y permitir la reacción).

Calentar los tubos en un baño maría hasta que hiervan durante 10 minutos.

La reacción sera positiva si la muestra se vuelve de color rojo y sera negativa si queda azul o cambia a un tono azul-verdoso.

2ª parte
La sacarosa es un disacarido que carece depoder reductor (porque en el enlace de los monosacaridos que forman parte de su molécula participan los carbonos
anoméricos), por lo que la reacción con el reactivo de Fehling es negativa, tal y como se ha visto en la 1ª parte.

Sin embargo, en presencia de HCl y en caliente, la sacarosa se hidroliza y se descompone en los monosacaridos que la forman, glucosa y fructosa, que sí son reductores.

La prueba de que se ha verificado la hidrólisis se realiza con el reactivo de
Fehling y, si el resultado es positivo, aparecera un precipitado rojo (tras el calentamiento en baño maría a ebullición, durante 10 minutos).

Si el resultado es negativo, la hidrólisis no se habra realizado correctamente, y si en el resultado final aparece una coloración verde en el tubo de ensayo se debe a una hidrólisis parcial de la sacarosa.

Para llevar a cabo esta parte de la practica:

Tomar 3 ml de solución de sacarosa y añadir 10 gotas de HCl diluido.
Calentar a la llama del mechero durante unos 5 minutos.
Dejar enfriar.
Neutralizar, añadiendo 3 ml de solución alcalina.
Realizar la prueba de Fehling como se indica en la 1ª parte.

Cuestiones.

1. Establecer a qué se deben las diferencias observadas entre los cuatro carbohidratos analizados (glucosa y fructosa dan positiva la reacción de Fehling, mientras que sacarosa y almidón no dan positiva la reacción).

Los monosacaridos (glucosa y fructosa) y la mayoría de los disacaridos tienen poder reductor ya que los grupos cetónicoso aldehído al oxidarse y pasar a un grupo acido desprenden electrones, que son captados por los iones Cu2+ se reducen y pasan a iones Cu+ , los cuales forman Cu2O que da un precipitado de color rojizo.

La sacarosa es el único disacarido que no tiene poder reductor sobre el reactivo de Fehling ya que el enlace se realiza entre el –OH del carbono anomérico del primer monosacarido y el -OH del segundo monosacarido.

Los polisacaridos, como el almidón, al tener un solo –OH hemiacetalico por molécula libre presenta un caracter reductor tan pequeño que no se consideran como reductores.

2. Analizar e interpretar los resultados obtenidos tras la hidrólisis de la sacarosa

La sacarosa es un disacarido que carece de poder reductor porque forma un enlace dicarbonílico y no tiene ningún OH hemiadetalico ( de los carbonos anoméricos).

Sin embargo en presencia de HCl y en caliente, la sacarosa se hidroliza y se descompone en los monosacaridos D-glucosa y D-fructosa.

La prueba de que se ha verificado la hidrólisis se realiza con el reactivo de Fehling y, si el resultado es positivo aparecera un precipitado rojo ( tras el calentamiento en baño maría a ebullición durante 10 min)

Si el resultado es negativo, la hidrólisis no se habra realizado correctamente y si en el resultado final aparece una coloración verde en el tubo de ensayo se debe a una hidrólisis parcial de la sacarosa.

PRACTICA 4.
Extracción y aislamiento de ADN.
Objetivos.

Romper o lisar con detergentesla pared celular, la membrana plasmatica y
la membrana nuclear para dejar libre el ADN y hacer que precipite en alcohol, para
poder visualizar las fibras del ADN.

Introducción.

ADN es la abreviatura del Acido Desoxirribonucleico. Es la molécula de la vida, pues constituye el material genético de todos los organismos vivos y se encuentra en el interior del núcleo de las células. EL ADN es el componente químico primario de los cromosomas y el material que constituye los genes. Su función esencial es la de conservar la información durante la división celular, transmitirla de generación en generación y hacer efectiva la información genética que contiene.

La extracción de ADN de una muestra celular se basa en el hecho de que los iones salinos son atraídos hacia las cargas negativas del ADN, permitiendo su dispersión coloidal y posterior extracción de la célula. Se empieza por lisar (romper) las células, vaciandose su contenido molecular, procediéndose a continuación a su protección frente a enzimas que puedan degradarlo, para conseguir finalmente su aislamiento, haciéndolo precipitar en alcohol.

Material.

Guisantes.
Agua destilada.
Detergente lavavajillas.
Sal (NaCl).
Zumo de piña o de papaya.
Alcohol de 96º muy frío.
Tubos y vasos de plastico.
Colador.
Cucharilla de café.
Batidora.
Hielo.
Gasa para colar.

Manipulación.

Preparación del tampón de extracción: en un vaso echamos media cucharadita de detergente de lavavajillas, una pizca desal y media cucharadita de zumo de piña. Añadimos 30 ml de agua destilada.

A continuación, se mezcla esta solución con 30 g de guisantes y se procede a triturar la mezcla, con el mortero (en este caso se adicionan 2 g de sal gorda para que actúe como abrasivo) o la batidora (a velocidad maxima durante 30 segundos).
Los jabones utilizados como lavavajillas emulsionan los lípidos de las membranas celulares y, ayudados por la trituración con el mortero o la acción de la batidora, son capaces de romper la pared celular y las membranas plasmatica y nuclear. La sal evita la unión de las proteínas al ADN y solvata sus cargas negativas. Los zumos de piña y papaya contienen un enzima, la papaína, que contribuye a eliminar las proteínas que puedan contaminar o degradar el ADN.

Filtramos el líquido obtenido con un colador y gasa.

Llenamos la mitad de un tubo con la disolución filtrada.


Añadimos cuidadosamente la misma cantidad de alcohol muy frío, haciéndolo resbalar muy despacio por las paredes del tubo, para que forme una capa sobre el filtrado, no debiendo mezclarse el filtrado y el alcohol.

El alcohol frío se utiliza para precipitar el ADN en la interfase formada entre el alcohol y el agua.

Dejamos reposar durante 2 ó 3 minutos.

En la interfase de las dos soluciones aparecen unos filamentos de ADN que van emigrando hacia la fase alcohólica. Podemos ayudar a la migración del ADN efectuando movimientos de rotación (suavemente) del tubo de ensayo. Losfilamentos de ADN acaban aglomerandose, formando un precipitado de aspecto algodonoso.


Cuestiones.

1. ¿Para qué se utiliza el detergente y el NaCl en la extracción?

Romper o lisar con detergentes la pared celular, la membrana plasmatica y la membrana nuclear para dejar libre el ADN.

2. ¿Qué componente aporta el zumo de piña o de papaya y cual es su utilidad?

El zumo de piña o el de papaya contienen un enzima, la papaína, que elimina las proteínas que pueden contaminar o degradar el ADN.

3. ¿Por qué se incorpora finalmente el etanol frío al medio?

El ADN es soluble en agua e insoluble en alcohol, de modo que al añadir alcohol lentamente a la disolución se produce la precipitación del ADN en la interfase.








PRACTICA 5.
Cultivo de levaduras. Estudio de la Respiración.

Objetivo.

Estudiar la producción de CO2 durante la respiración e investigar el efecto de un inhibidor de la glicólisis.

Introducción.

La respiración es un proceso por el cual las células obtienen energía, mediante la degradación de compuestos organicos tales como los azúcares, de alto contenido energético.

La glicólisis consiste en la conversión de un azúcar sencillo (hexosa) en dos moléculas de piruvato. Esta ruta, practicamente común a todos los seres vivos, consta de varios pasos catalizados enzimaticamente. Uno de ellos, el paso de 2-Fosfoglicerato a
Fosfoenolpiruvato, esta catalizado por la enzima Enolasa, que necesita la presencia de iones Mg2+ para poder actuar.En presencia de iones F- , el Mg2+ se compleja en forma de MgF2, con lo cual, se inhibe la glicólisis y no hay respiración. En el transcurso de la glicólisis se producen, por cada molécula de glucosa, 2 moléculas de ATP, y otras dos de coenzimas reducidos (NADH + H+).

El piruvato puede sufrir distintas transformaciones dependiendo del tipo de organismo y de las condiciones en que se encuentre. En presencia de O2, los seres aerobios y los anaerobios facultativos continúan la oxidación del piruvato, a través del ciclo de Krebs y de la cadena de transporte de electrones de las mitocondrias, hasta dar CO2 y H2O como productos finales. Los organismos anaerobios estrictos, y los facultativos en ausencia de O2, transforman el piruvato en otros compuestos mas reducidos, para regenerar el NAD+ necesario para continuar la glicólisis, con lo cual la mayor parte de la energía de la glucosa es desaprovechada. Esta vía se conoce con el nombre de fermentación y, dependiendo del producto final, se le llama alcohólica, lactica, etc.…
En el caso que vamos a estudiar, las levaduras Saccharomyces cerevisiae son organismos facultativos que, en ausencia de O2, producen CO2 y etanol a partir del piruvato, por lo cual son muy utilizados industrialmente, por ejemplo, en la fabricación de la cerveza.




Material.

Levaduras en suspensión acuosa, durante 24 h, a 25ºC.
Disolución de glucosa al 5%.
Disoluciones de NaF 0,01, 0,05 y 0,10 M.
Tubos de ensayo para respirómetro.

Manipulación.Antes de empezar a operar, rotule 5 tubos graduados, numerandolos del 1 al 5 en la parte cerrada del tubo.

Para construir el respirómetro simple, llene con suspensión de levaduras, agua, solución de glucosa e inhibidor, según se indica a continuación en la tabla.


Coloque un tubo de ensayo grande (de mayor diametro que el graduado) sobre el graduado, introduciéndolo lo mas posible y, presionando ambos, invierta el conjunto rapidamente, de manera que derrame la menor cantidad de líquido posible.

Se mide el volumen de aire que queda entre el líquido y el fondo del tubo graduado e invertido, y se anota.


Si las levaduras respiran, el CO2 desprendido se acumulara en la camara de aire, aumentando la presión sobre el líquido, con lo que éste sera desplazado y el volumen gaseoso aumentara.

Al cabo de una hora aproximadamente, midiendo el volumen final de la camara gaseosa y restandolo del inicialmente obtenido, tendremos una medida de la cantidad de respiración que haya tenido lugar.

Cuestiones.

1. Razonamiento sobre los procesos que estan ocurriendo en cada uno de los 5 tubos.

Tubo 1: levadura + agua destilada. Es un tubo control o testigo en el que no cabe esperar que suceda nada, ya que las levaduras no tienen nutrientes para utilizar como combustible metabólico. Es posible que aparezca una cantidad de gas casi inapreciable, desprendido de la degradación de las mínimas reservas que pueden tener las células.

Tubo 2: levadura + agua destilada +glucosa. En este tubo, las levaduras disponen de glucosa como nutriente por lo que como resultado de la respiración se desprendera una cantidad muy apreciable de gas.

Tubo 3: levadura+ glucosa + NaF. La presencia de un fluoruro en el medio celular provoca la inhibición del proceso, al formarse un complejo (MgF2) con el flúor y con iones Mg2+ que intervienen como cofactores de enzimas glucolíticas.
En la realidad se observa un desprendimiento de gas, pero a continuación se estabiliza y no se sigue desprendiendo.

Tubos 4 y 5: levadura+ glucosa + concentraciones crecientes de NaF. La presencia de una elevada proporción del inhibidor reduce el desprendimiento inicial del gas.

2. ¿Cual es la función del tubo 1?

Es un tubo control o testigo.

3. ¿Por qué se añade glucosa a los tubos 2, 3, 4 y 5?

Como nutriente para que se lleve a cabo la fermentación alcohólica y se desprenda CO2.

4. Diferencias observadas en los tubos 3, 4 y 5 (inhibición parcial o total, dependiendo de la concentración del inhibidor).

La diferencia radica en las diferentes concentraciones del inhibidor de la glucólisis (NaF) presentes en los tubos 3,4 y 5, menores concentraciones (tubos 3 y 4) inhiben parcialmente el proceso lo que se demuestra por la presencia de cantidades decrecientes de CO2 que comprimen cada vez menos al líquido contenido en el tubo. A mayores concentraciones (tubo 5) no se aprecia desprendimiento de gas (el líquido se sitúa a la misma altura que en el tubo control).