LABORATORIO “EXTRACCION DEL ADN”



MARCELA BEDOYA GONZALEZ
LUISA FERNANDA GUEVARA ZUÑIGA
ANA MARIA MURILLO URREA



USC- PALMIRA
SEMESTRE III
2013 B

laboratorio “extraccion del adn”

MARCELA BEDOYA GONZALEZ
LUISA FERNANDA GUEVARA ZUÑIGA
ANA MARIA MURILLO URREA


TRABAJO PRESENTADO A NATALI VALENTINA PAYARES
EN EL CURSO DE BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR II


INTRODUCCION
Los acidos nucleicos tienen como principales funciones la transmisión y expresión de la información genética. A través de estas funciones determinan no solo la estructura sino que también regulan todos los procesos fisiológicos y metabólicos de los seres vivos. Existen dos tipos de acidos nucleicos, denominados acido desoxirribonucleico (ADN) y acido ribonucleico (ARN), estos compuestos son polímeros de nucleótidos, los cuales a su vez se conforman de tres moléculas diferentes (azúcar pentosa, base nitrogenada y fosfato).

El estudio de la estructura y propiedades de los acidos nucleicos ha permitido la comprensión de procesos asociados a mecanismos de enfermedades genéticas e infecciosas, respuesta inmune, desarrollo de células cancerosas y resistencia a antibióticos, los cuales han sido empleados en una serie de campos de la salud. El analisis de la secuencia de los acidos nucleicos así como el desarrollo tecnológico de sus procesos, han sido la base para el diseño de vacunas, producción de farmacos, mejoramiento de la calidad nutricionalde especies vegetales y animales, resistencia vegetal a plagas, control de enfermedades parasitarias, terapia y regulación génica.


OBJETIVOS

1. Realizar la extracción de ADN a partir de células humanas de la mucosa bucal
2. Analizar la importancia de la extracción de ADN en la investigación en salud humana.
3. Analizar el efecto de los diferentes compuestos empleados en la técnica sobre la estructura y propiedades de los acidos nucleicos.
4. Determinar la utilidad de la técnica de electroforesis en la observación y separación de la molécula de ADN.
5. Analizar la utilidad de la tinción de ADN en su observación.



RESPUESTAS DEL CUESTIONARIO DE ACIDOS NUCLEICOS
1.

2) Explique la función o fundamento de los siguientes reactivos en la extracción de ADN:

a) El SDS: En los laboratorios, el SDS se emplea comúnmente en la preparación de proteínas para electroforesis en gel de poliacrilamida(SDS-PAGE). El SDS actúa rompiendo enlaces no covalentes en las proteínas, desnaturalizandolas, provocando que estas moléculas proteicas pierdan su conformación nativa. Esto ocurre porque el SDS se une a las zonas apolares del polipéptido. Ademas, la cantidad de SDS unido es similar para muchas proteínas: una molécula de SDS por cada dos residuosaminoacidos, correspondiendo a unos 1 g SDS/g proteína. Ello proporciona al polipéptido una carga negativa que resulta proporcional a la longitud de la cadena (el número de aminoacidos) y, por tanto, a la masa molecular de la proteína. Este aporte de carga negativaes sustancialmente mayor que la carga original de la proteína. La repulsión electrostatica creada por la unión del SDS a la proteína es uno de las causas de que la proteína pierda su conformación nativa, eliminandose de este modo las diferencias en conformación de las diferentes proteínas que han de ser separadas en el gel.
Aunque el SDS se conocía también como SLS, existe una importante diferencia entre ambos. El SDS tiene cadena ramificada, de ahí su desuso actual en detergentes dado que la degradación de cadenas lineales es mucho mas efectiva. De hecho, el cambio del SDS por el SLS ha contribuido eficazmente (aunque no ha puesto fin) al problema medioambiental que provocan los detergentes.


b) El cloruro de sodio
en la extracción de ADN se utiliza cloruro de sodio o acetato de sodio para que los iones sodios (Na+) interaccionen con los grupos fosfato cargados negativamente del ADN. De esta forma los fosfatos no interaccionan con las moléculas de agua, ya que sus cargas negativas son 'bloqueadas' por el sodio y el ADN se vuelve mas insoluble, y así se favorece su precipitación.

c) Etanol al 96%
El etanol limpia el ADN de otras biomoléculas por un proceso llamado 'precipitación'. En este proceso, el etanol hace que el ADN se deshidrate, es decir, pierda contacto con las moléculas de agua que lo rodean, y lo aisla de la solución acuosa para dejarlo libre de impurezas. Ademas, con la ayuda de sales de sodio, por ejemplo NaCl, facilitas este aislamiento de ADN y su separación por centrifugación.


3.Cómo se llaman las proteínas asociadas con el DNA y que propiedad las caracteriza desde el punto de vista de purificación del DNA
Las proteínas asociadas al ADN se conocen colectivamente con el nombre de histonas. Son polipéptidos relativamente cortos cargados positivamente (basicos) y por lo tanto son atraídos por las cargas negativas del ADN (acido) Las histonas son sintetizadas en cantidad durante la fase S ( S por síntesis) del ciclo celular. Una de las funciones de esas proteínas esta relacionada con el empaquetamiento del ADN en la forma del cromosoma: los 2 metros de ADN de la célula humana son empaquetados en 46 cromosomas de un largo combinado de aproximadamente 200 nm. La célula tiene unas 90 millones de moléculas de histonas siendo la mayoría perteneciente a un tipo conocido como H1. Se conocen cinco tipos de las siguientes histonas (H1, H2A, H2B, H3, y H4 , 8 moléculas en total); con la excepción de la H1 la mayor parte de las histonas de los eucariotas son muy similares.

4. Explique porque es posible observar el ADN con Luz UV cuando se tiñe con Bromuro de etídio. Cual es el mecanismo de tinción de este reactivo
Es posible observar el ADN con luz UV cuando se tiñe con bromuro de etidio, ya que este es un compuesto intercalante, es decir que tiene afinidad para unirse al DNA, pues se introduce en la estructura secundaria de la doble hélice de este y se acopla energéticamente a los acidos nucleicos que lo forman. Su utilidad deriva así mismo de su fluorescencia, exaltada al encontrarse en un entornohidrófobo es decir al estar unido al ADN.

5. Investigue el fundamento de la electroforesis en gel de agarosa y explique porqué el ADN es atraído por el polo positivo.
La electroforesis en gel es un método que se emplea para separar macromoléculas en función del tamaño, la carga eléctrica y otras propiedades físicas. El término electroforesis describe la migración de las partículas cargadas bajo la influencia de un campo eléctrico. «Electro» se refiere a la electricidad y «foresis», del griego phoros, significa «trasladar». Así pues, la electroforesis en gel es una técnica consistente en aplicar corriente eléctrica a las moléculas para que atraviesen una placa de gel. La fuerza motriz de la electroforesis es la tensión eléctrica aplicada a los electrodos en ambos extremos del gel. Las propiedades de una molécula determinan la velocidad con que un campo eléctrico puede desplazarla a través de un medio gelatinoso.
La electroforesis en gel de agarosa es un método normalizado que se utiliza para separar, identificar y purificar fragmentos de ADN. Se trata de una técnica sencilla y rapida que permite diferenciar fragmentos de ADN que no pueden separarse adecuadamente con otros procedimientos. Por otra parte, el ADN puede localizarse en el gel tiñendo con una concentración baja de bromuro de etidio, que es un agente intercalante fluorescente que se utiliza como colorante.
Muchas macromoléculas biológicas importantes (por ejemplo, los aminoacidos, los péptidos, las proteínas, los nucleótidos y los acidos nucleicos)poseen grupos ionizables y, a un pH determinado, existen en solución como especies cargadas eléctricamente, sean cationes (+) o aniones (-). Según la naturaleza de la carga neta, las partículas cargadas migraran hacia el catodo o hacia el anodo. Así, por ejemplo, cuando se aplica un campo eléctrico a un gel con pH neutro, los grupos fosfato del ADN cargados negativamente lo haran migrar hacia el anodo.
6. Investigue que tipo de colorantes pueden emplearse para teñir el ADN.
Los colorantes que se utilizan para la tinción del ADN son basicos, los cuales son sales en las que la base aporta el color, mientras que la parte acida es incolora. Esto es debido a que los colorantes basicos tienen apetencia por sustancias acidas del tejido como el ADN o ciertos componentes de la matriz extracelular como los glucosaminoglucanos. Así, ponen de manifiesto el núcleo y el ARN, sobre todo el ARNr presente en los ribosomas por ser muy abundante, así como ciertas matrices extracelulares ricas en componentes acidos. Ejemplos de colorantes basicos son la tionina, safranina, azul de toluidina, el azul de metileno o la hematoxilina
De los colorantes anteriores tomaremos como ejemplo a la tionina (acetato) que pertenece al grupo de los colorantes de la tiazina. La tionina (acetato) se usa para diferentes tinciones como la visualización de la sustancia de Nissl, para la tinción metacromatica de granulos de mastocitos, la visualización del pigmento lipofuscina y la tinción con tionina-verde de metilo para ADN/ARN.


7.APLICACIONES DEL ADN EN LA MEDICINA

OBTENCIÓN DE PROTEINAS DE MAMÍFEROS
Una serie de hormonas como la insulina, la hormona del crecimiento, factores de coagulación, etc tienen un interés médico y comercial muy grande. Antes, la obtención de estas proteinas se realizaba mediante su extracción directa a partir de tejidos o fluidos corporales.
En la actualidad, gracias a la tecnología del ADN recombinante, se clonan los genes de ciertas proteinas humanas en microorganismos adecuados para su fabricación comercial.
Un ejemplo típico es la producción de insulina que se obtiene a partir de la levadura Sacharomyces cerevisae, en la cual se clona el gen de la insulina humana.











OBTENCIÓN DE VACUNAS RECOMBINANTES

El sistema tradicional de obtención de vacunas a partir de microorganismos patógenos inactivos, puede comportar un riesgo potencial.

Muchas vacunas, como la de la hepatitis B, se obtienen actualmente por ingeniería genética. Como la mayoría de los factores antigénicos son proteínas lo que se hace es clonar el gen de la proteína correspondiente.








DIAGNÓTICO DE ENFERMEDADES DE ORIGEN GENÉTICO

Conociendo la secuencia de nucleótidos de un gen responsable de una cierta anomalía, se puede diagnosticar si este gen anómalo esta presente en un determinado individuo. En el siguiente dibujo se explica brevemente la base del diagnóstico.



OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES.

Este proceso abre las puertas para luchar contra enfermedades como el cancer y diagnosticarloincluso antes de que aparezcan los primeros síntomas.





PRUEBAS DE PATERNIDAD

Una prueba de paternidad genética se basa en comparar el ADN nuclear de ambos. El ser humano al tener reproducción sexual hereda un alelo de la madre y otro del padre. Un hijo debe tener para cada locus un alelo que provenga del padre. Esta comparación se realiza comparando entre 13-19 locus del genoma del hijo, del presunto padre y opcionalmente de la madre, en regiones que son muy variables para cada individuo llamadas STR (Short Tandem Repeat).
































CONCLUSIONES
-se puede concluir que la electroforesis es un método que se utiliza para separar, identificar y purificar fragmentos de ADN.
-la visualización del ADN bajo la luz ultravioleta es posible gracias a la presencia de bromuro de etidio, el cual se une a las cadenas de ADN facilitandonos su observación.

-Las histonas tienen la función de 'empaquetar', por asi decirlo, el ADN ya que este da una vuelta y media en cada histona.
Estan formadas por 4 subunidades, y pues como durante la replicacion es necesario abrir las cadenas de ADN uno se puede preguntar ¿que pasa con las histonas mientras esto ocurre?, es muy simple; las histonas cuentan con una especie de 'brazos' los cuales retienen al ADN, durante la replicación, estos 'brazos' digamos que se sueltan un poco, permitiendo a la cadena de ADN alejarse un poco de la histona, pero al terminar dicho proceso lo acercan a ella nuevamente.
- El ADN es unpolímero que se encuentra en el núcleo de todas las células. ADN interactúa con numerosas proteínas que realizan sus funciones junto con el ADN. Algunas proteínas que entran en contacto con ADN incluyen varios ADN modificación de enzimas y algunas proteínas.






















INTRODUCCIÓN

La Reacción en Cadena de la polimerasa (PCR) permite obtener mas de 10 millones de copias de una cadena de ADN de interés a partir de pocas moléculas de ésta. La sensibilidad de ésta técnica requiere de cuidados para que la muestra no esté contaminada previamente con otras cadenas de ADN que pudieran generar amplificados.
Existen numerosas técnicas que emplean la PCR (RAPD, RFLP, RTPCR) con diferentes aplicaciones en campos de diagnóstico, criminología, e investigación.


OBJETIVO

1. Conocer la metodología basica para amplificar una cadena de interés por medio de la reacción en cadena de la polimerasa.

2. Conocer la aplicación y utilidad de esta técnica en la biología molecular


RESPUESTAS DEL CUESTIONARIO DE PCR


DIAGRAMA DE FLUJO DE PCR




1. La técnica del PCR consiste en tres pasos:

Paso 1º PCR: Desnaturalización por calor.
El calor (generalmente > 90°C) separa la doble hebra de ADN en dos filamentos, esto se conoce como “desnaturalización'.
Puesto que los enlaces del hidrógeno que unen las bases de uno a otro son débiles, se rompen a altas temperaturas, mientras que los enlaces entre fosfatos y desoxirribosa, que son enlaces covalentes mas fuertes, permanecen intactos. 

 

Ciclo PCR - Paso 1º: Desnaturalización por calor
 
Paso 2º PCR: Alineación – unión de la sonda a la secuencia diana.
El objetivo no es replicar la hebra entera de ADN sino replicar la secuencia diana de aproximadamente 100-600 pares de bases que es única en el organismo.
Los iniciadores marcan el final de la secuencia diana: éstos son sintéticos y cortos, creados a partir de una hebra única de ADN y que normalmente constan de 20-30 bases, con una marca de biotina 5’ al final para ayudar a la detección.
Two primers are included in the PCR, one for each of the complementary single DNA strands that was produced during denaturation. The beginning of the DNA target sequence of interest is marked by the primers that anneal (bind) to the complementary sequence.
Temperatura de Alineación: generalmente ocurre entre 40°C y 65°C, dependiendo de la longitud y la secuencia de bases de los iniciadores. Permite que éstos se unan a la secuencia diana con alta especificidad.
 

 
Ciclo PCR - Paso 2º: Un par de iniciadores biotinilados se unen al final de la secuencia diana.
 
Paso 3º PCR: Extensión
Una vez que los iniciadores se han unido a las secuencias complementarias de ADN, la temperatura se eleva aproximadamente a 72°C y la enzima Taq polimerasa replica los filamentos de ADN.
La Taq ADN polimerasa es una ADN polimerasa recombinante termoestable del organismo Thermus aquaticus, que a diferencia de otras polimerasas se mantiene activa a elevada temperatura. Comienza el proceso de síntesis en la regiónmarcada por los iniciadores y sintetiza una nueva hélice de ADN de doble hebra, ambas idénticas al original, para facilitar la unión de los nucleótidos complementarios que quedan libres en la solución (dNTPs).
La extensión comienza siempre en el extremo 3' del iniciador creando una doble tira a partir de cada una de las hebras individuales. La Taq ADN polimerasa sintetiza exclusivamente en la dirección 5’ a 3’. No obstante los nucleótidos libres en la solución sólo se añaden al extremo 3`del iniciador, construyendo la tira complementaria de la secuencia de ADN.
 

 
Ciclo PCR - Paso 3º: La Taq ADN polimerasa cataliza la extensión de los iniciadores de modo complementario. Se incorporan los nucleótidos
 
 
Final del primer ciclo de PCR
Al final del primer ciclo de PCR, nos encontramos dos nuevas tiras de ADN idénticas al original.
Punto final: La ADN polimerasa no reconoce el final de la secuencia. Las nuevas hebras formadas tienen un principio, definido precisamente por el extremo 5’ del iniciador, aunque el extremo 3' no queda definido.
Mientras que el número de ciclos aumenta, una hebra con una longitud mas definida sirve como plantilla para la nueva secuencia sintetizada.
La hebra de ADN sintetizada a partir esta plantilla tiene una longitud definida que esta limitada por el extremo 5’ de cada uno de los dos iniciadores. Estas hebras de ADN se denominan AMPLICONES.
Después de algunos ciclos, las hebras de DNA que corresponden a la secuencia diana, estan presentes en un número mucho mayor que lassecuencias de longitud variable.
En otras palabras la secuencia flanqueada o definida por los dos iniciadores es la sección que se amplifica.
 

 
Final del primer ciclo de PCR – Resultan dos copias de la secuencia target



1.
SUSTANCIA
FUNCIÓN
ADN molde
Formar el cebador
Iniciador sentido 10 u M

Iniciador antisentido 10 uM

Buffer PCR 10 X

25 mM MgCl2

dNTPs

Agua MilliQ esteril

Taq polimerasa (5U/uL)



2. Durante la PCR, se utilizan altas temperaturas para lograr que las moléculas se separen en cadenas simples.

Y de acuerdo a la temperatura:

Un ciclo de uno a varios minutos a 94-96 ºC, durante la cual el ADN se desnaturaliza y se separa la doble hélice en las cadenas simples de ADN.

Un ciclo de uno a varios minutos a 50-65 ºC durante el cual los iniciadores se unen (mediante puentes de hidrógeno) a sus secuencias complementarias a cada lado de la secuencia en cuestión.

Un ciclo de uno a varios minutos a 72 ºC, durante el cual la Taq polimerasa se une y extiende la cadena complementaria de ADN entre cada iniciador. La clave de este paso es que esta polimerasa específica puede ser activa a esta temperatura, cualidad que otras polimerasas no poseen (las polimerasas presentes en otros organismos se inactivan a altas temperaturas).

3. La técnica de la PCR (Polymerase Chain Reaction= Reacción en Cadena de la Polimerasa) permite la amplificación de un fragmento de ADN de interés. El uso de esta técnica es muy amplio en el campo de la medicina.
Con la técnica de la PCR(Polymerase Chain Reaction= reacción en cadena de la polimerasa) es posible obtener millones de copias de un fragmento del ADN (por ejemplo, de un gen de interés). La proteína que lleva a cabo el proceso de copia de las cadenas del ADN es la ADN polimerasa. En el primer ciclo de la PCR se consigue duplicar el fragmento de interés porque cada cadena del ADN sirve de molde para la síntesis de otra cadena. Como en cada ciclo aumenta el número de cadenas que sirven de molde para la ADN polimerasa, en tan sólo 25 ciclos de copia la técnica de la PCR permite obtener millones de copias de un fragmento que se encontrara presente como copia única al comenzar el proceso. La PCR es una técnica valida para diferentes aplicaciones médicas que requieran una concentración alta de un fragmento concreto del ADN: para identificar anomalías en la secuencia de nucleótidos que apunten a posibles patologías, para identificar a un individuo o averiguar su parentesco con otros ya que el patrón de nucleótidos del ADN es característico de cada individuo o para detectar la presencia de ADN de microorganismos útil en el diagnóstico de infecciones o para probar la eficacia de un tratamiento.



CONCLUSIONES

- la desnaturalización por calor del ADN se da generalmente por encima de los 90 grados centígrados provocando la separación de la doble hebra de ADN en dos filamentos.
-se puede concluir que la técnica de PCR es utilizada en diferentes aplicaciones médicas que nos ayudan a identificar anomalías en la secuencia de nucleótidos.