Osmolaridad Plasmatica y permeabilidad de la membrana celular

Introducción

La membrana celular posee diversos mecanismos que permiten mantener la homeostasis en el organismo, permitiendo, por ejemplo, la regulación del pH o de la concentración de iones.

Esta capacidad, se debe principalmente a la permeabilidad de la membrana plasmatica, la cual permite el paso selectivo de solutos como también permite el paso de moléculas tan esenciales como el agua. El agua, se mueve a través de la membrana plasmatica debido a la diferencia de presión osmótica existente entre el medio intra y extra celular, lo cual es determinado por la diferencia de concentración (osm/L) de las partículas que no difunden a través de la membrana. De esta manera, una mayor concentración en el medio extracelular, genera el ingreso de agua, produciéndose hemólisis (rompimiento de la membrana celular) o bien crenacion (salida de agua de la célula).

Todo esto define a la osmolaridad, la cual es una medida de la cantidad de partículas disueltas en una cantidad conocida de solvente. De esta manera, la permeabilidad de la membrana celular permite mantener el equilibrio osmótico celular.

‘Soluciones de distinta composición y concentración inducen un cambio en la permeabilidad de la membrana, permitiendo mantener el equilibrio interno, lo que se encuentra relacionado con la osmolaridad del plasma ‘

Para lo anterior se estudió la permeabilidad de la membrana al analizar la respuesta de la célula frente a cambios en el medio extracelular (soluciones isotónicas, hipotónicas, hipertónicas), observandose hemólisis en las muestras de sangre en medio hipertónico, y crenacion en medios hipotónicos. Paralelamente se estudio la osmolaridad del plasma, mediante calculos realizados luego de centrifugar muestras sanguíneas en capilares de hematocrito.

Materiales y Métodos

Se tomo un tubo de 15 mL con sangre, posteriormente se rotularon 6 tubos de ensayo, a los cuales se le agregó 2mL de soluciones de NaCl dediferentes concentraciones de acuerdo a la tabla 1.

Se agito suavemente por inversión la sangre contenida en el tubo, luego con un capilar para microhematocrito se tomo una muestra de sangre y se sello en un extremo con plasticina. Este se rotulo como testigo 1

Posteriormente a los tubos de ensayo que contenían las soluciones de NaCl se le añadió 0,5mL de sangre, se cerraron cada uno de los tubos con parafilm y se agitaron suavemente por inversión, luego con capilares para microhematocrito se tomaron muestras de cada uno de los tubos, una vez terminado este procedimiento, se mezclo por inversión nuevamente la sangre contenida en el tubo y se tomo una muestra con un capilar para microhematocrito, este fue denominado testigo 2.

Una vez que se tuvo los 8 capilares para microhematocrito se llevaron a la centrifuga dispuesta para ello.

Cuando se termino la centrifugación, se tomaron los capilares y se llevaron a un papel milimetrado y se midió la cantidad de glóbulos rojos y el total, para así calcular el porcentaje, tomando en consideración el factor de dilución.

Tabla 1

|Tubo |Concentración |
|  |gr/L |mol/L |
|Testigo 1 | ---- | ---- |
|Solución 1 |5,85 |0,1 |
|Solución 2 |7,31 |0,125 |
|Solución 3 |8,77 |0,15 |
|Solución 4 |10,23 |0,175 |
|Solución 5 |11,7 |0,2 |
|Solución 6 |14,15 |0,242 |
|Testigo 2 | ---- | ---- |

Paso 2

Se rotularon 13 tubos de ensayos, a cada uno de estos se le agregó cierta cantidad de soluciones que se muestran en la tabla 2, para evitar contaminaciones, para agregar cada solución se ocuparon pipetas diferentes en cada ocasión, se taparon los tubos con parafilm y se agitaron por inversión, para lograr mezclas homogéneas, luego con unamicropipeta, se agregó una gota de la muestra de sangre y se agito por inversión, se tomo el tiempo que se demoraron los eritrocitos en hemolizar, esto se percibió cuando las soluciones pasaron de turbias a transparentes, esto puede demorar de segundos a minutos, si una muestra demoró mas de un minuto, se controlaron esta cada 2 minutos hasta un maximo de 20, si a este tiempo no se observaron cambios, se llevo estas muestras a hematocrito.

Para determinar el hematocrito de las muestras no hemolizadas, se tomaron 100uL de sangre y 400uL de la solución correspondiente y se llevaron a un tubo eppendorf, se agitaron por inversión, luego con un capilar de microhematocrito se tomo una muestra de cada una de ellas, sellando un extremo del capilar con plasticina, se llevaron a la centrifuga correspondiente donde se colocaron por 5 minutos.

Posteriormente se sacaron los capilares y en una escala graduada o en papel milimetrado, se calculó el porcentaje de volumen de eritrocitos.

|Tubo |Cantidad |Solución |
|1 |5 mL |Agua destilada |
|2 |5 mL |NaCl 0,05M |
|3 |5 mL |NaCl 0,15M |
|4 |5 mL |NaCl 0,30M |
|5 |5 mL |Urea 0,1M |
|6 |5 mL |Urea 0,3M |
|7 |5 mL |Urea 0,6M |
|8 |5 mL |Tritón 0,1% |
|9 |5 mL |NH4Cl 0,15M |
|10 |5 mL|Sacarosa 0,3M |
|11 |2,5 mL |NaCl 0,3M Urea 0,6M |
|12 |2,5 mL |NaCl 0,30M NH4Cl 0,30M |
|13 |2,5 mL |NaCl 0,30M Sacarosa 0,8M |

Resultados

A partir de los experimentos realizados para estudiar la osmolaridad del plasma, se obtuvieron los siguientes resultados para cada grupo.

1° Grupo

|Tubo |Concentración |Osmolaridad |Hematocrito (%) |
gr/L |mol/L |Osmol/L |mosmol/L |Medido |corregido |
|Testigo 1 | ---- | ---- | ----- |------- |24,24 |24,24 |
|Solución 1 |5,85 |0,1 |0,2 |200 |6,56 |*32,8 |
|Solución 2 |7,31 |0,125 |0,250 |250 |4,76 |*23,8 |
|Solución 3 |8,77 |0,15 |0,30 |300 |3,57 |*17,85 |
|Solución 4 |10,23 |0,175 |0,35 |350 |3,38 |*16.9 |
|Solución 5 |11,70 |0,2 |0,40 |400 |3,50 |*17,5 |
|Solución 6 |14,15 |0,242 |0,484 |484 |4,83 |*24,15 |
|Testigo 2 | ---- | ---- | ------ | ------ |23,73 |23,73 |

Tabla 1: Tabulación de los valores de eritrocitos obtenidos en los tubos del grupo 1 y también su corrección



Como se observa en la tabla de resumen no todas las muestrashemolizaron, es decir las celulas se enfretaron a soluciones isotónicas o hipertónicas en relación a su concentración intracelular ya que no se produjo ruptura de membrana. Por lo que dichas muestras se llevaron a un hematocrito para poder calcular volumen de los eritrocitos.

|Tubo |Cantidad |Tiempo |Solución |Osmolaridad |Hematocrito (%) |Tonicidad |
|1 |5 mL |11 seg |Agua destilada |0 | -- |Hipotónica |
|2 |5 mL |30 seg |NaCl 0,05M |0,1 | -- |Hipotónica |
|3 |5 mL | -- |NaCl 0,15M |0,3 |22,35 |Hipertónica |
|4 |5 mL | -- |NaCl 0,30M |0,6 |21,75 |Hipertónica |
|5 |5 mL |48 seg |Urea 0,1M |0,1 | -- |Hipotónica |
|6 |5 mL |28 seg |Urea 0,3M |0,3 | -- |Hipotónica |
|7 |5 mL |1,04 min |Urea 0,6M |0,6 | -- |Hipotónica |
|8 |5 mL |10 seg |Tritón 0,1% |0,1 | -- |Detergente |
|9 |5 mL |5,20 min |NH4Cl 0,15M |0,3 | -- |Hipotónica |
|10 |5 mL | -- |Sacarosa 0,3M |0,3 |14,7 |Hipertónica |
|11 |2,5 mL | -- |NaCl 0,3M |1,2 |15,15 |Hipertónica |
Urea 0,6M | |
|12 |2,5 mL | -- |NaCl 0,30M |1,2 |17,85 |Hipertónica |
NH4Cl 0,30M
|13 |2,5 mL | -- |NaCl 0,30M |1,4 |9,7 |Hipertónica |
Sacarosa 0,8M

Grupo 2:

|Hematocrito |Medida |Medida corregida (x factor de dilución)|% |
|T1 |12 mm |12 mm |17,14 |
|1 |2 mm |10 mm |14,3 |
|2 |2 mm |10 mm |14,3 |
|3 |5 mm |25 mm |35,7 |
|4 |2 mm |10 mm |14,3 |
|5 |2 mm |10 mm |14,3 |
|6 |1 mm |5 mm |7,15 |
|T2 |11,5 mm |11,5 mm |16,43 |
|Promedio T1 y T2 |11,75 mm |11,75 mm |16,78 |

Tabla A. Seconsidera como valor correspondiente al 100%, 70 mm (7 cm), ya que esta es la medida total de muestra en el capilar de hematocrito.



Grupo 3

Medido |Corregido |Concentraciones |Osmolaridad |
|Testigo 1 |17.64 |88.20 |
|Solución 1 |4.83 |24.15 |0.100 |0.20 |
|Solucion2 |3.67 |18.35 |0.125 |0.25 |
|Solución 3 |3.17 |15.85 |0.150 |0.30 |
|Solución 4 |2.85 |14.25 |0.175 |0.35 |
|Solución 5 |2.89 |14.49 |0.200 |0.40 |
|Solución 6 |2.20 |11.00 |0.240 |0.48 |
|Testigo 2 |17.14 |85.70 |



Discusión

Permeabilidad de la membrana plasmatica

A partir de los resultados obtenidos, podemos observar los cambios ocurridos en la célula al encontrarse en soluciones de distinta concentración. De esta forma, encontramos que aquellas células que se encontraban en medios hipertónicos (sobre 0.15M) lisaban rapidamente, lo cual era apreciable gracias al brusco cambio de color. Lo anterior se produce debido, al ingreso excesivo de agua hacia el interior de la célula. Pues, al haber una mayor concentración en el medio externo, el agua ingresa para equiparar las concentraciones y así mantener el equilibrio.Sin embargo se observaron muestras en donde no se producía hemólisis, de manera que estas células, o se encontraban en un medio hipotónico, (crenacion de la célula) o bien, estaban en uno isotónico, en donde al estar en equilibrio el medio externo con el interno no se produce un cambio de volumen significativo, lo que se traduce en una mantención del color característico.

Lo anterior, fue estudiado mediante hematocrito, los cuales señalan un aumento en los casos XXX? O bien su disminución para los casos XXX del volumen celular, pero no necesariamente una ruptura de la membrana. Esto se podría deber a que si bien las células no se encontraban en un medio isotónico, pueden alcanzar el equilibrio luego de un cierto tiempo (20 minutos aproximadamente), lo cual justifica el aumento o disminución del volumen celular.

En relación a los tiempos de hemólisis, observamos que las células en medio hipertónico lisaban a un tiempo similar, lo cual se aprecia en el promedio (SACARLO) de los tres grupos del laboratorio. Esto, justifica la gran permeabilidad al agua que tiene la membrana al momento de producirse un cambio de concentración, generando una rapida respuesta, que en estos casos, llevaban a la ruptura de la membrana celular.

Sin embargo encontramos casos en donde el proceso de hemólisis tardó mas tiempo, como son en los casos de las soluciones X Molar. Esto podría deberse a que si bien el medio en que se encontraban era hipertónico ??, la diferencia de concentración entre el medio intra y extra celular no era tan grande, de manera que la célula ‘trato’ de alcanzar un equilibrio, el cual, al no alcanzarse produce este rompimiento de la membrana celular

No esta demas decir, que diversos factores como una mala homogenización de la muestra, pueden producir una diferencia de tiempo entre lo diferentes grupos. Pues algunas células estarían en contacto directo con la solución hipo o hipertónica, mientras que otras, tardarían mas tiempo, al no estar en contacto directamente.