Mediante las reacciones coloreadas, las enzimáticas ó de inmunofluorescencia se averigua la composición bioquímica de las estructuras celulares, su localización y su funcionamiento.
Las Reacciones Enzimáticas:
-son específicas y controladas.

- dependen de factores como: temperatura, pH y la presencia de sales.

- son difíciles de ver a simple vista.
Inminofluorescencia
La inmunofluorescencia es una técnica de laboratorio y su exactitud puede variar dependiendo del anticuerpo específico que se está investigando y del laboratorio que la esté aplicando. Se corta una porción congelada del hígado de un ratón (u otras substancias) y se coloca en una laminilla portaobjeto de un microscopio, luego una pequeña cantidad de suero sanguíneo de la persona (parte líquida de la sangre que contiene los anticuerpos) se coloca sobre la sustancia y se lava. Un medio de contraste (fluoresceína) que se ha enlazado químicamente a los anticuerpos anti-humanos del conejo se aplica y se lava. Finalmente el anticuerpo del conejo enlazado a la fluoresceína y algunos anticuerpos humanos se enlazan, permitiendo que los grupos de medios de contraste sean visibles bajo el microscopio (prueba positiva).

5.3 Métodos histológicos
Definición de Histología
Etimología: Histo: Tejido
Logos: Aprendizaje
Definición: Estudio de los tejidos.
i€€Ciencia que se dedica al estudio morfológico microscópico y funcional delos tejidos, la célula (citología) y de la estructura de los órganos.

Histología
Los tejidosanimales (incluidos los humanos) están divididos en 4 grupos fundamentales:

•Tejido epitelial
•Tejido conectivo
•Tejido muscular
•Tejido nervioso

Métodos de estudio en histología
1.-Microscopía de luz :
-Histoquímica: - Técnica corriente.
(Hematoxilina y eosina).
- Técnicas especiales.
-Inmuno histoquímica: Demuestra presencia de antígenos
Utilizando anticuerpos marcados.

Los métodosparala obtención de preparaciones histológicas ocupadas en los estudios de microscopia óptica, se engloban en la Técnica Histológica.

La Técnica Histológica abarca varios procedimientosa los que se somete un tejido para proporcionar los cortes como se conocen, montados bajo un cubre objeto con imágenes de estructurascontrastadas, para su estudio bajo microscopia óptica o electrónica.
Los procedimientos de la Técnica Histológica se resumen en las etapas siguientes
Para empezar con la técnica histológica se debe obtener una MUESTRA DEL TEJIDO a estudiar y existen 2 formas:
• Necropsia: Examen u obtención de tejido de un organismo muerto.
• Biopsia:(del griego bios= vida y oasis = visión) Examen u obtención de tejido de un organismo vivo. Puede ser inscisional, excisional, por sacabocado, por punción y absorción, por raspado, por trepanación.
•
Fijación
Este procesose refiere al tratamiento del tejido con sustancias químicas que tienen varias finalidades:
1. Conservar los tejidos de forma que muestren el mayor parecido posible a su estado in vivo.
2. Aumentar la dureza del tejido para facilitar la preparación de finas películas de éste.
3. Destruir bacterias ygérmenes que pudieran encontrarse en ellos.
4. Interrumpir los procesos celulares dinámicos que ocurren a la muerte de la célula.
Esto se logra al inactivar ciertas enzimas celulares que de otra manera iniciarían la Autolisis y llevarían a la DEGENERACIÓN POST MORTEM.
La fijación mantiene las estructuras al estimular la formación de enlaces cruzados entre las proteínas.
Los agentes más usados para Microscopia de Luz son
Formaldehído al 5%, Formol al 10% o Formalina (Solución de Formaldehído especial)
• Puede usarse con amortiguadores o con otros fijadores.
• Reacciona con los grupos aminos de las proteínas, formando enlaces transversales y conservando las estructuras de la célula.
• Es el más usado es el Formol al 10%.
Glutaraldehído al 2.5%, Tetróxido de Osmio, Líquido de Helly y Fijador de Bouin
• Funcionan formando enlaces transversales en las proteínas y manteniendo las estructuras de la célula.
• El fijador de Bouin es una solución que contiene 75 ml de solución acuosa saturada de ácido pícrico, 25 ml de formol y 5 ml de ácido acético glacial.
• El líquido de Helly es una solución con 2.5 g de bicromato de potasio, 5 g de cloruro de mercurio, 100 ml de agua y 5 ml de formol.
Cloruro de Mercurio y Ácido Picrico
• Precipitan las proteínas.
Para Microscopia Electrónica se usan
Glutaraldehído al 2.5%, Para formaldehído, Tetróxido de Osmio y Permanganato de Potasio.
• Permiten conservar detalles estructurales finos, ya que otros fijadores como el formaldehído, son muy enérgicos en su acción con las proteínas.
• Actúan como colorantes electrodensos, permitiendo observaral tejido con el haz de electrones.
• Una solución de Glutaraldehído al 2.5% en un tampón a pH 7.4, evita la violenta desnaturalización de las proteínas guardando detalles finos de la célula. Es el más usado en Microscopia Electrónica.
Regla de Oro para la Fijación
• La mejor fijación es cuando a pasado el menor tiempo entre la muerte del tejido y la fijación.
• Tamaño de la Muestra
• El tamaño de la muestra debe de ser de 2-3 cm. variando el estudio para lo cual se va a utilizar.

Deshidratación
Después que la muestra ha sido fijada se elimina el fijador y se deshidrata.
Debido a que una gran parte del tejido está constituida por agua, se aplica una serie gradual de soluciones acuosas de menor a mayor de agente deshidratante, por ejemplo, Alcohol Etílico o Acetona. Iniciando con alcohol al 50 %, luego con una solución de 60%, 70%, 80%, 90%, 96% y alcanzando de manera paulatina el alcohol al 100 % para eliminar el agua. Esto se hace porque si se colocara el tejido en una solución al 100% de alcohol inmediatamente, el agua saldría muy rápido del tejido y se deformaría.
Aclaramiento o diafanización
Luego de deshidratar el tejido, se pasa a una solución de una sustancia que es miscible tanto con el alcohol como con el medio de inclusión a utilizar (en la mayoría de los casos se utiliza como medio de inclusión Parafina líquida). La sustancia comúnmente utilizada es el Xileno o Xilol.
De la misma manera se coloca la muestra de tejido en un recipiente de Xilol, el Xilol solo es soluble en alcohol al 100%. Se llama aclaramiento ya que el tejido se torna transparente o claroen el xileno, esto se debe a que cambia su índice de refracción. También se pueden utilizar Tolueno, Benzol o Cloroformo como medios de aclaramiento.
NOTA: El alcohol y el xileno disuelven los lípidos de la célula y por lo cual al extraerse también se extraen las grasas y los lípidos de la célula.
Inclusión o impregnación
A fin de que se puedan obtener cortes suficientemente finos para ser observados al microscopio, los tejidos tienen que ser incluidos y envueltos por una sustancia de consistencia firme. Las sustancias usadas para este fin son: gelatina y parafina.
El objeto de la inclusión es
• Distinguir entre sí las células superpuestas en un tejido y la matriz extracelular.
• Tener un objeto lo suficientemente duro para su manejo y corte.
La inclusión se logra al infiltrar la parafina liquida o cualquier medio de inclusión en estado líquido al tejido, que disuelve el medio de aclaramiento y penetra en el tejido. Por lo general se coloca la muestra de tejido en un recipiente y se le agrega la parafina fundida a 60s C, colocando la muestra en una estufa de 30 minutos a 6 horas manteniendo la temperatura a 60s C.

Debido al calor, el xilol o el benzol se evaporan y los espacios anteriormente ocupados por ellos son ahora ocupados por la parafina. Después se coloca la pieza y un poco de parafina fundida en un molde de papel o metal de forma rectangular y se deja solidificar a temperatura ambiente, formándose un bloque sólido de parafina con el trozo de tejido incluido, a este bloque se le denomina Taco.

Los medios de inclusión para Microscopia Electrónica comúnmenteutilizados son resinas polimerizadas o epoxi como:

• Epon
• Micrópilo
• Araldit
Sección o corte
El taco ahora se puede cortar en secciones lo suficientemente delgadas como para permitir el paso de la luz. La mayor parte de los preparados para microscopia óptica tienen un grosor entre 3 a 10 micrómetros. Para estos cortes se utiliza un aparato llamado MICROTOMO.
Cuando deseamos estudiar grasas o lípidos que se extraen en el proceso de aclaramiento o enzimas que quedan inactivadas por el calentamiento de la inclusión, nos auxiliamos con la Técnica de Congelación de Tejidos. Un tejido congelado, es los suficientemente duro para ser cortado.
Se sumerge la muestra de tejido en Nitrógeno líquidopara tener una congelación rápida. Luego se corta con un aparato especial denominado MICROTOMO DE CONGELACIÓN, existe un aparato más elaborado y eficiente para los cortes de congelación llamado CRIOSTATO.La ventaja de esta técnica es que los cortes que se obtienen son muy rápidos, se puede utilizar en el diagnostico de material patológico, tomado en intervenciones quirúrgicas y el resultado se obtiene en el transcurso de una operación.
Para Microscopia Electrónica se requieren cortes más delgados (denominados ultra finos) de aproximadamente 25 a 100 nm. de espesor y de 0.5 mm.de lado medio. Para esto se utiliza un MICROTOMO CON HOJA DE VIDRIO O DIAMANTE. Una vez preparados, se montan sobre rejillas de cobre con un diámetro de 3mm
Montaje y tinción
Los cortes todavía no son aptos para su examen con el microscopio, puesto que los tejidos se hallan infiltrados en parafina y carecen decolor.
Los cortes se colocan sobre portaobjetos a los que se les ha agregado una pequeña cantidad de Albúmina, la cual actúa como adhesivo.
La parafina se elimina en un solvente orgánico, de nuevo se incluyen en Xilol, y la muestra se rehidrata haciéndola pasar por una serie de graduaciones decrecientes de alcohol etílico hasta llegar a una solución 100% de agua.
Ya rehidratado se TIÑE EL TEJIDO. Los colorantes más utilizados son la HEMATOXILINA Y la EOSINA.Una vez teñido, se deshidrata de nuevo, de tal manera que pueda fijarse de modo permanente el CUBREOBJETOS con un medio adecuado para el MONTAJE (por ejemplo una gota de Bálsamo de Canadá o similar). Los medios de montaje pueden ser miscibles o no miscibles en agua, si son miscibles en agua ya no es necesaria la deshidratación después del teñido, se puede montarlo directamente. El cubreobjetos no solo protege el tejido, sino que se requiere para observar el corte con un microscopio.

Los colorantes pueden agruparse en 3 clases
• Colorantes que diferencian los componentes ácidos y básicos de la célula.
• Colorantes especializados que distinguen los componentes fibrosos de la matriza extracelular.
• Sales metálicas que se precipitan en los tejidos y forman depósitos de metales con ellos.

APÉNDICE: Laminilla Histológica: Superficie plana y delgada en donde se encuentra montada una preparación de tejido permanente. Se compone de tres partes:
• PORTAOBJETOS
• CORTE O TEJIDO
• CUBRE OBJETOS
FUNDAMENTOS QUÍMICOS DE LA COLORACIÓN
La EOSINAes un colorante ácido y sus propiedades tintoriales pueden ser explicadas sobre labase de lo que se sabe acerca de la acción de las anilinas ácidas. La HEMATOXILINAaunque no es un colorante básico, posee propiedades muy semejantes a las anilinas básicas.

Un colorante básico es una molécula de anilina que tiene una o más cargas positivas en su porción coloreadas y su fórmula general se representa:
ANILINA+ Cl-
Los COLORANTES BÁSICOS reaccionan con los GRUPOS ANIÓNICOS de los componentes texturales, que son los grupos fosfato de los ácidos nucleicos (ADN y RNA), los grupos SULFATO de los glucosa minoglucanos y los GRUPOS CARBOXILO de las proteínas. La reacción de estos grupos varía según el pH.
Como ya se mencionó, la Hematoxilina no es un colorante básico en sentido estricto. Se la utiliza con un Mordiente (Intermediario), entre el componente textural y la anilina, y es debido a este que la coloración con hematoxilina se asemeja a la tinción que produce un colorante básico. La unión en el complejo TEJIDO – MORDIENTE – HEMATOXILINA, no consiste en un simple enlace, y cuando la Hematoxilina se coloca en agua no se disocia del tejido, sino que permanece firmemente adherida. A causa de esto, la Hematoxilina se presta para aquellos procedimientos tintoriales en los que a ella le sigue la Eosina u otros colorantes ácidos.
Los colorantes básicos verdaderos no suelen usarse en secuencia en donde el colorante básico es seguido por uno ácido, porque la anilina básica tiende a disociarse del tejido durante los lavados posteriores en soluciones acuosas.
Un COLORANTE ÁCIDOlleva una carga negativa en la porción coloreada de la molécula y su fórmula general serepresenta:
Na+ ANILINA-
Los colorantes ácidos se unen primariamente a los componentes texturales por medio de enlaces electrostáticos de manera similar pero opuesta a la de los colorantes básicos. Las anilinas ácidas reaccionan con grupos catiónicos, como los GRUPOS AMINO IONIZADOS de las proteínas.
Cualquier componente de los tejidos que reaccione con un colorante básico (o con Hematoxilina) se dice que es BASÓFILO y que presenta BASOFILIA. Estos componentes son
• La Heterocromatina y los Nucléolos del Núcleo por los grupos Fosfato ionizados.
• Ergatoplasma (parte del citoplasma) por grupos Fosfato ionizados.
• Matriz del Cartílago por grupos Sulfato ionizados.
Los componentes texturales que se tiñen de colorantes ácidos se dice que son ACIDÓFILOS y que presentan ACIDOFILIA. Son acido filos
• La mayor parte del citoplasma no especializado.
• Filamentos Citoplasmáticos.
• Fibras extracelulares.
Todos estos debidos a grupos Amino ionizados.

Metacromasia
Es el fenómeno por el cual un colorante (por ejemplo Azul de Toluidina o la tionina) cambia de color tras reaccionar con un componente textural.
Esto se debe a que en tejidos con altas concentraciones de POLIANIONES, la molécula del colorante se polimeriza entre si y sus propiedades de absorción son diferentes de las propiedades de las moléculas individuales. Se interpreta que la metacromasia refleja gran cantidad de cargas aniónicas muy cercanas unas a otras en el tejido, una situación prevalerte en la sustancia fundamental del cartílago y en los gránulos de los mastocitos, el Azul de Toluidina tiñe a estos de colorpúrpura.
Los componentes titulares que pueden colorearse metacromáticamente, denominados Cromotropos, son principalmente los glucosaminoglucanos sulfatados y las nucleoproteínas.

Métodos basados en la reacción de schiff para grupos aldehído

El Reactivo de Schiffes la leucofucsina o bisulfato de fucsina. Es incoloro, pero puede formar un color rojo estable producto de adición con grupos aldehído. Este compuesto se utiliza en combinación con otros productos químicos como
El Método del ácido peryódico-Schiff (PAS)se emplea para determinar la presencia de moléculas como el glucógeno, glucoproteínas y glucosaminoglucanos.
Lo que hace es romper la unión de los anillos de las hexosas formando grupos aldehído o rompen los enlaces de las hexoaminas de los glucosaminoglucanos, también formando grupos aldehído y haciéndolos reaccionar a estos grupos con el reactivo de Schiff. También sirve para identificar membranas basales y fibras reticulares.
El Método de Feulgen este es un métodoespecífico para la determinación histoquímica del DNA, donde la hidrólisis ácido débil con cloruro de hidrógeno (HCl) se separan los grupos púricos del DNA. De este modo se abre el anillo de desoxirribosa, y se forma un grupo aldehído que reacciona con el reactivo de Schiff. Se obtiene un color magenta o rojo. No se tiñe el RNA.

Determinación histoquímica de lípidos
Luego de la fijación con formalina se realizan cortes por congelación, por lo que se evita extraer los lípidos con los solventes orgánicos.
Para la determinación histoquímica se emplean muy a menudo los denominados COLORANTES SUDÁN. Estos soncasi insolubles en agua. El colorante Sudán se emplea disuelto en un solvente orgánico en el cual los lípidos sean relativamente insolubles, y en el que también el colorante sea sólo parcialmente soluble. Además, el colorante debe ser más soluble en lípidos que en el solvente, puesto que la coloración tiene lugar porque las moléculas del colorante se distribuyen entre los lípidos y el solvente en relación con su solubilidad en ambos.
Para evitar la extracción del colorante y los lípidos, luego de la coloración se montan los cortes en medio acuosos.
Los colorantes Sudán tiñen fuertemente los TRIGLICÉRIDOS, como por ejemplo
• Rojo de sudán o sudán iii, en la coloración de células adiposas.
• El negro de sudán o sudán iv, se emplea en la coloración de las vainas mielínicas de las fibras nerviosas compuestas por lipoproteínas.
Finalmente hay métodos que utilizan varios colorantes y que colorean diferentes estructuras tisulares y que desconociendo las bases químicas en cómo se unen con los componentes se denominan Métodos no específicos, como el Tricrómico de Mallory.
También puede emplearse una modificación de la reacción de PAS – ocasionalmente denominada Método PA-plata- para la microscopia electrónica. Luego de la oxidación con ácido peryódico se emplea por lo general como reactivo la metenamina-plata. El producto final de reacción será electrodenso.