Dilución en Serie de Bacterias en Placas de Agar para la Cuantificación de Células Viables
Moisés Del Valle, José Corchado, José Manuel Rivera, Yarimar Suarez ,Efren Vargas Departamento de Ciencias y Tecnología,
Universidad Interamericana de Puerto Rico, Recinto de Aguadilla, Aguadilla P.R
21 de Septiembre del 2011

La importancia e infinita posibilidades que tienen los microorganismos para el mundo han llevado la microbiología a estudiar y aplicar la amplia gama de usos y beneficios que tienen. Existen investigaciones en el analisis de materiales como el agua, la leche, la comida, en algunos casos el aire y requieren la enumeración cuantitativa de microorganismos en estas. En este experimento se utilizo el método dilución en serie-placa agar, este siendo uno de los mas eficientes. El laboratorio se divisó en tres procedimientos. Se comienza con los especímenes de bacterias que se obtuvieron de tierra recolectada en el campo universitario. Luego se diluyo la tierra en agua esterilizada y se transfirió con pipetas a cinco placas de cultivo, cada una con concentraciones especificas. La segunda parte de nuestro experimento con llevo la preparación del medio de nutriente TSA (Trypticase Soy Agar) y su decantación en las cinco placas con el contenido de las diluciones respectivamente. Las placas se transfirieron a incubadoras con temperaturas óptimas por un periodo de 24 horas para su cultivación. Finalmente se observaron las bacterias y se cuantifico el número de células viables encada cultivo utilizando la formula de CFU (Colony Forming Units). En sumario pudimos concluir que a mayor dilución menor fue la cantidad de bacterias (células viables).

Introducción:

Microorganismos son aquellos organismos vivos que son tan pequeños que no pueden ver a simple vista, para poder observarlos y estudiarlos es necesario el uso de un microscopio. En su mayoría los microorganismos son unicelulares e individuales y presentan una morfología elemental. En otros casos se traten de organismos multicelulares con estructuras complejas. El primero en observar microorganismos fue Anton Van Leeuwenhoek, quien en 1767 creó un microscopio de un lente e hizo una observación en donde notó la presencia de microorganismos. Van Leeuwenhoek se encargó de describir y dibujar lo que vio a través de su microscopio. Desde entonces muchos científicos se han encarga.

La teoría dice que una colonia proviene de una sola celula por lo tanto cada microorganismo se cuenta como una unidad formadora de colonia o en ingles “Colony Forming Unit (CFU)”. Lo que nos da un estimado de la cantidad de celunas en una muestra. Para poder contar dicha cantidad en la microobiologia se utilizan diferentes técnicas entre ellas el proceso de dilución en serie.
Una dilución en serie es la reducción progresiva, paso a paso, de la concentración de una sustancia. Comúnmente, el factor de dilución en cada paso es constante, lo que obtenemos como resultado una progresión geométrica de la concentración en formalogarítmica. El factor de dilución es el número total de volúmenes al que se lleva un volumen dado de muestra original. Ademas, el factor de dilución también corresponde a la división de la concentración de la muestra original sobre la concentración de la muestra diluida. En biología y medicina, la dilución en serie también se puede utilizar para reducir la concentración de microorganismos o células de una muestra. Como por ejemplo, el número y tamaño de las colonias de bacterias que crecen en una placa de Petri, depende de la concentración y dado que muchas otras técnicas de diagnóstico implican contarfísicamente el número de microorganismos o células en ciertas areas impresas dentro de dicha placa.
En este experimento se tomara una muestra de suelo de una parte de la universidad para aplicar el proceso de dilución en serie y observar el crecimiento de colonias. Existe una gran diversidad de microorganismos que viven en el suelo. El número y tipos de microorganismos presentes en el suelo dependen de diversos factores ambientales como son los nutrientes, humedad, aireación, temperatura, pH, practicas agrícolas, entre otros. Existen del orden de varios miles de millones de bacterias por gramo de suelo. La mayor parte son heterótrofos, siendo comunes los bacilos esporulados, los actinomicetos.
Este trabajo tiene como objetivo aprender a realizar la dilución en serie, preparación del medio de cultivo TSA y la cuantificación de las colonias viables. La hipótesis que podemos establecer esque a mayor dilución menor sera el factor de crecimiento de las colonia

Materiales y método
Para el proceso de dilución en serie se utilizo una botella con 90 ml de NaCl 0.5 M esteril, 10g de suelo, 6 tubos con 9 ml de agua destilada esteril y 6 tubos con medio TSA esteril.
En la botella se anadieronnlos 10 gramoa de suelo y se agito vigorosamente, utilizando medidas acepticas y una pipeta esteril se transfirió un ml a uno de los tubos de ensallo rotulado con el numero #1,se agito vigorosa mente. Del tubo #2 utilizando una nueva pipeta se transfirió un ml al tubo #2. Del tubo #1 utilizando una nueva pipeta se transfirió un ml al


tubo #3. Del tubo #3 utilizando una nueva pipeta se transfirió un ml al tubo #4. Del tubo #4 utilizando una nueva pipeta se transfirió un ml al tubo #5. Del tubo #5 utilizando una nueva pipeta se transfirió un ml al tubo #6.
Del tubo #4 se extajo 0.1ml y se sembro en un plato petri. De los tubos 5,6,7 respectivamente se extrajo 0.1 ml y 1ml, se sembro en un plato petri. Luego de rotular los platoa petri se anadio el medio TSA derretido acada plato. Cuando el medio se solidifico se incubo de manera invertida a 37°Cpor un periodo de 24-28 horas.


Resultados
Tabla 1.1
Numero de tubo | Volumen de transferencia(ml) | Cantidad de colonias observadas (CFU) | CFU X factor de dilución |
4 | 0.1 | 5 | 5.0 x 105 |
5 | 0.1 | 5 | 5.0 X 105 |
| 1 | 6 | 6 X 106 |
6 | 0.1 | 6 | 6 X 106 |
| 1 | 0| 0 X 107 |





Discusión
Para hacer crecer los organismos aislados del suelo se utilizo el medio TSA el cual es un medio para una gran cantidad diferente de micoorganismos especial mente bacterias pero también algunos hongos pueden crecer sin ningún problema. Según las características de las colonias recuperadas en el laboratorio podemos suponer que todo el crecimiento obtenido fue de bacterias. Las placas fueron incubadas a una temperatura de 37°C la cual es una tempera tura optima para bacterias mesofilas cuyo rango de temperatura es de 20°C a 45°C. A dicha temperatura no se espera un agran presencia de hongos ya que para muchos de ellos su temperatura ideal es de 25°C y no fue lo que obtivimos durante el laboratorio.
En la diliucion en serie se observo la disminución de el numero de CFU a manera que el factor de dilución aumentaba lo que indica que mientras mas diluida este la muestra menor sera la cantidad de microorganismos presentes. El proceso de dilución en serie tene siertas desventajas yaq que si los tubos no se agitan de la menara correcta los microorganismos se pueden presipitar y no creecen en las placas lo cual altera los resultados.
Conclucion
En la muestra de suelo había un promedio de 5 X 106 CFU X gramo de suelo. Se comprobó que a meyor dilución menor la cantidad de miroorganismos presentes.


Referencias
Cappuccino, James G. & Sherman, Natalie. Microbiology: A Laboratory Manual. Benjamin Cummings.