QUÍMICA ANALÍTICA
Espectrometría de luminiscencia molecular
Fluorescencia, fosforescencia y quimioluminiscencia
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
ÍNDICE
Introducción………………………………………………………………………..3
1. Teoría de la fluorescencia y de la fosforescencia…………………………….4
1.1 Estados excitados que producen fluorescencia y fosforescencia…………4
1.2 Ley cuantitativa de la fluorescencia……………………………………….11
1.3 Variables que afectan a la fluorescencia……………………………………13
2. Instrumentos para la medida de la fluorescencia y
de la fosforescencia………..15
3. Aplicaciones de los métodos
fotoluminiscentes…………………………………19
4. Quimioluminiscencia……………………………………………………………..20
Bibliografía……………………………………………………………………………21
INTRODUCCIÓN
Se define la luminiscencia como la desactivación de un estado electrónico
excitado de átomos o moléculas. El término de luminiscencia recoge todos
aquellos métodos ópticos en los que las moléculas del analito se
excitan para dar una especie cuyo espectro de emisión suministra información
para el análisis cuantitativo y cualitativo. Se pueden distinguir los
siguientes tipos de luminiscencia en función del modo en que se
excitan las moléculas: Fotoluminiscencia: Las moléculas se excitan por
absorción de radiación UV-Vis. Incluye la fluorescencia y la fosforescencia. Es el más utilizado desde el punto de vista analítico.
Quimioluminiscencia: Se produce cuando una reacción química genera una especie
electrónicamente excitada que emite luz cuando vuelve
a su estado fundamental o que transfiere su energía a otra especie que,
posteriormente, da lugar a una emisión. No necesitafuente de radiación.
Bioluminiscencia: Es la luminiscencia que tiene lugar en los organismos debido
a un proceso bioquímico. Radioluminiscencia: La
radiación ionizante (rayos X, alfa, beta y gamma) son los que provocan la
excitación de la molécula. Catodoluminiscencia: Es la excitación molecular
mediante rayos catódicos, es decir, debido a la exposición del analito a un
haz de electrones. Electroluminiscencia: La excitación se lleva a cabo a través
de un campo eléctrico. Termoluminiscencia:
Calentamiento de las moléculas para su excitación. Triboluminiscencia: Se
emplean fuerzas electrostáticas y de fricción. Sonoluminiscencia: Utilización
de ultrasonidos para la excitación molecular.
De entre todos estos métodos analíticos, se van a considerar para su estudio la
fluorescencia, la fosforescencia y la quimioluminiscencia, los cuales están
íntimamente relacionados.
TEORÍA DE LA FLUORESCENCIA Y DE LA FOSFORESCENCIA
El fenómeno de fotoluminiscencia ocurre cuando una especie química es excitada
por medio de radiación electromagnética y como
consecuencia la especie pierde la energía adquirida reemitiendo ésta en forma
parcial o total. Esto es, parte de la energía adquirida por la especie química
se reemite en forma de choques moleculares y parte en forma de energía luminosa
o el total de la energía adquirida se reemite en forma de radiación.
La fluorescencia es un proceso de emisión en el cual
las moléculas son excitadas por la absorción de radiación electromagnética. Las especies excitadas se relajan al estado fundamental, liberando
su exceso de energía en forma de fotones. La fosforescencia es el
fenómenoque se produce cuando una molécula se excita electrónicamente
(absorbancia) y su posterior desactivación transcurre con un
cambio de spin en el electrón (pasa del estado
singulete a triplete mediante un cruce de sistemas) desde el nivel inferior
vibracional del
primer estado electrónico excitado al nivel fundamental.
La fluorescencia y la fosforescencia tienen en común el hecho de que la
excitación se obtiene mediante la absorción de fotones, lo que conlleva que se
conozca a ambos fenómenos con el término más general
de fotoluminiscencia.
La diferencia entre fluorescencia y fosforescencia consiste en que el primer
fenómeno no supone un cambio de espín electrónico. Como consecuencia, la fluorescencia presenta un tiempo de vida medio inferior a la fosforescencia, donde
el cambio en el espín del
electrón hace que la radiación se mantenga durante un tiempo fácilmente
detectable.
1.1 Estados excitados que producen fluorescencia y fosforescencia
Para explicar la fotoluminiscencia es
necesario explicar cómo tiene lugar la absorción de la radiación
electromagnética de una molécula. Para ello partimos de un
diagrama de orbitales moleculares (OM). Dos OM surgen de la combinación de
dos orbitales atómicos (OA).
Los OM se dividen en tres tipos: enlazantes, antienlazantes y no enlazantes.
Los electrones ocupan los OM de acuerdo con el principio de exclusión de Pauli
(sólo dos electrones por cada dos OM, no puede haber dos electrones con el
mismo estado cuántico, es decir, con los cuatro números cuánticos iguales),
principio de mínima energía (así los electrones ocupan los OM enlazantes y no
enlazantes, que son losde menor energía) y principio de máxima multiplicidad de
Hund.
En el estado fundamental, los electrones ocupan los OM enlazantes y no enlazantes (los de menor energía).
A dicho estado fundamental de la molécula se le denomina
estado singlete. Esta denominación viene dada a partir del
concepto de multiplicidad de espín, que se define como
M = 2S + 1
M = Multiplicidad del espín. S = |Σsi| = suma total del espín de cada
uno de los electrones de la molécula = espín neto de la molécula. si = espín de los electrones = ± ½ Suponemos que en el
estado fundamental todos los electrones se encuentran apareados (moléculas
diamagnéticas, no son atraídas ni repelidas por campos magnéticos externos). La
suma total de los espines, es decir, el espín neto de la molécula, es cero, y
la multiplicidad del
espín es igual a uno. Es lo que se denomina estado singlete
(S0). A partir de ese estado fundamental, por
absorción de radiación electromagnética, a una determinada longitud de onda, se
promociona uno de los electrones del estado
fundamental de los OM enlazantes o no enlazantes a un OM
antienlazante. El estado fundamental tiene un nivel
energético determinado, que recibe el nombre de nivel energético del estado fundamental. En el caso de la absorción de radiación UV, los electrones se
mueven al OM antienlazante.
Para comprender la diferencia entre los dos fenómenos luminiscentes es
necesario hacer referencia al espín del electrón y a los estados
excitados singlete y triplete.
En el caso de que no se produzca un cambio del espín del electrón
que es promocionado al OM antienlazante, el
espín neto de la molécula siguesiendo igual a cero (S=0), de manera que M = 1. Se denominan estados excitados singlete. Estos estados
contienen más energía que el estado fundamental, y para distinguirlos se les
añade un subíndice (1, 2, 3…) según aumente la energía
de los estados (S1, S2, S3…). Por el contrario, cuando el electrón promocionado
al OM antienlazante cambia el número cuántico de espín en el proceso (por
ejemplo, de -1/2 a +1/2), el espín neto de la molécula es igual a uno (S=1) y
la multiplicidad del
espín es igual a tres (M=3). Este estado electrónico se
denomina estado triplete excitado.
El estado triplete excitado se encuentra a un nivel
energético inferior al del estado singlete
excitado, de forma que, en una escala de energía, se encontraría entre la
energía del estado fundamental (S0) y la
energía del
primer estado singlete excitado (S1). De acuerdo con la regla de selección de
los saltos electrónicos, los únicos saltos posibles son aquellos en los que no
hay cambio del número
cuántico, es decir, que la multiplicidad del
espín (M) no cambie. Por tanto, los saltos en absorción
molecular tienen lugar entre S0 y S1 o entre S1 y S2, dependiendo de la
longitud de onda empleada. No existe probabilidad de salto de S0 a T1
(transición prohibida). Como consecuencia
de estos saltos electrónicos se obtienen espectros de absorción molecular, que
son bandas.
Estado singlete fundamental
Estado singlete excitado
Estado triplete excitado
Una molécula excitada puede volver a su estado fundamental mediante una
combinación de varias etapas mecanísticas. Dos de estas etapas conllevan
la emisión de un fotón de radiación. Las otras etapasde desactivación son procesos no radiantes.
La relajación no radiante implica la pérdida de energía a través de una serie
de pequeñas etapas en las que la energía de excitación de una molécula se
transforma en energía
cinética al colisionar con otras moléculas (se produce un
pequeño aumento de la temperatura del
sistema). El cambio más propicio hacia el estado fundamental es aquel que
minimiza el tiempo de vida del estado excitado.
La fluorescencia de moléculas implica una transición desde un
estado excitado de singlete hasta el fundamental de singlete. Esta transición
es muy probable, por tanto, la vida media de un estado
excitado de singlete es muy breve (10-5 s o menos). El mecanismo de
fluorescencia únicamente se observa en determinadas muestras, concretamente
alrededor de un 20% de las moléculas orgánicas. Por
otra parte, la fosforescencia molecular supone una transición de un estado de triplete excitado al estado fundamental de
singlete. Esta transición provoca un cambio en el
espín del
electrón, por lo que es mucho menos probable. En
consecuencia, el estado de triplete tiene una vida media mucho más larga
(habitualmente, 10-6 a 1s). La fosforescencia se observa sólo a bajas
temperaturas, en medios altamente viscosos o en moléculas que están absorbidas
sobre superficies sólidas.
A partir de los diagramas de OM
y de energía de los estados singlete y triplete se puede explicar el fenómeno
de la fotoluminiscencia. No obstante, hay que incluir los niveles
vibracionales de cada nivel electrónico. Esto es lo que se
denomina diagrama de Jablonski. Un diagrama de
Jablonski es aquel diagrama de energía queincluye tanto los niveles
electrónicos como
los vibracionales. Se encuentra representado en la siguiente
imagen (ilustración 1).
Ilustración 1. Diagrama de Jablonski.
La línea horizontal S0 representa la energía del
estado fundamental de la molécula, el cual normalmente es un estado singlete. A
este nivel electrónico, igual que en los otros estados
excitados, se encuentran asociados varios niveles vibracionales de la molécula.
A temperatura ambiente, este estado representa la
energía de prácticamente todas las moléculas en una disolución. Las dos líneas de la izquierda representan S1 y S2, que
corresponden al primer y al segundo estado singulete excitado respectivamente.
El de la derecha, T1, corresponde al primer estado triplete
excitado. Como se puede ver, el diagrama confirma que el estado triplete es menos
energético que el correspondiente estado excitado singlete.
A partir del
diagrama se pueden estudiar los procesos de desactivación por los cuales una
molécula excitada puede volver a su estado fundamental mediante una combinación
de varias etapas mecanísticas. Los dos mecanismos
fundamentales son la relajación (desactivación) no radiante y la relajación
fluorescente.
Relajación vibracional
Relajación no radiante Conversión interna
La relajación vibracional, señalada por las flechas onduladas cortas entre los
niveles de energía vibracionales, tiene lugar durante
las colisiones entre moléculas excitadas y las moléculas del disolvente. Durante estas colisiones el
exceso de energía vibracional se transfiere a las moléculas del disolvente en una serie de etapas como se indica en la
figura. Laganancia de energía vibracional del disolvente se refleja en un ligero
incremento de la temperatura del
medio. La relajación vibracional es un proceso tan
eficiente que el tiempo de vida promedio de un estado vibracional excitado es
de 10-15s aproximadamente. También se puede dar el relajamiento no radiante
entre el nivel vibracional inferior de un estado
electrónico excitado y el nivel vibracional superior de otro estado
electrónico. Este tipo de relajación, llamado conversión
interna, se representa con las flechas onduladas largas. En la figura se
ilustra el otro proceso de relajación: la fluorescencia molecular. Se puede
observar que las bandas de radiación se producen cuando las moléculas
fluorecen, debido a que las moléculas electrónicamente excitadas se pueden
relajar desde el estado electrónico excitado singlete de menor energía (S1) a
cualquiera de los estados vibracionales del estado electrónico fundamental
(Regla de Kasha).No obstante, existen ciertas moléculas en las que la
fluorescencia se produce desde el estado S2 hasta el estado S0 sin pasar por
ningún otro nivel. La fluorescencia es un mecanismo de
emisión espontánea. De igual forma que las bandas de absorción molecular, las
bandas de fluorescencia molecular están formadas por una multitud de líneas
espaciadas tan estrechamente que son muy difíciles de resolver. Empíricamente
se observa que el comportamiento fluorescente lo presentan con más frecuencia
compuestos en los que la transición es del tipo π, π* ya que tales
transiciones presentan tiempos de vida promedio más cortos y no aquellos
compuestos en los que la transición de menor energía es del tipo n *; esto es, la eficacia cuántica es mayor para
transiciones π, π*.
La fotoluminiscencia está limitada a un número
relativamente pequeño de sistemas que incorporan características estructurales
y ambientales que hacen que la velocidad de los procesos de desactivación sin
radiación se reduzcan hasta el punto que la reacción de emisión puede competir
cinéticamente. Como ya se ha dicho
anteriormente, el camino más probable hacia el estado fundamental es aquel que
minimiza el tiempo de vida media del estado excitado. Por tanto, si
la desactivación por fluorescencia es rápida con respecto a los procesos sin
radiación, se observa tal emisión. Por otro lado, si un camino sin radiación tiene una constante de velocidad
favorable, la fluorescencia no tiene lugar o es menos intensa. Por ende, la larga vida media de la fosforescencia es una de sus
desventajas. Es posible que procesos no radiantes
compitan con la fosforescencia y desactiven el estado excitado. Así
pues, la eficiencia del proceso de fosforescencia y su
intensidad son relativamente bajas. A fin de aumentar esta
eficiencia, se trabaja a bajas temperaturas y en medios rígidos.
Como ejemplo de
estos mecanismos de desactivación que pueden competir con la fluorescencia y
con la fosforescencia, se tienen los siguientes: transferencia de carga
intramolecular, cambio conformacional de la molécula, transferencia
electrónica, transferencia protónica, transferencia de energía, formación de
complejos y transformación fotoquímica.
En la figura 2, se observa que en la absorción los saltos de energía se
producen desde el nivel vibracional más bajo del estadoelectrónico fundamental
hasta distintos niveles vibracionales del nivel electrónico excitado y, en la
fluorescencia, se producen desde el nivel vibracional más bajo del estado
excitado (ya que previamente se ha producido una relajación vibracional de
mayor velocidad) hasta los distintos niveles vibracionales del estado
electrónico fundamental. Esto significa que en la fluorescencia los saltos
energéticos son más pequeños, como consecuencia de lo cual las
longitudes de onda correspondientes son más grandes con respecto a la
absorción. Este desplazamiento hacia longitudes de onda mayores es lo que se
conoce como
desplazamiento de Stokes. Los procesos en los que la radiación absorbida sea
emitida sin cambio en la longitud de onda (misma energía) se conocen como
radiación de resonancia o resonancia fluorescente. Esto sólo tiene lugar en el
salto energético desde el nivel más bajo del estado excitado al más alto del estado fundamental.
Debido a que las diferencias de energía entre los estados vibracionales son
aproximadamente las mismas, tanto absorción como en emisión, frecuentemente
aparece el espectro de excitación (absorción) como una imagen especular del
espectro de fluorescencia (emisión) con una sobreposición que ocurre en la
línea de resonancia, es decir, en la línea a la que la radiación absorbida sea
emitida sin cambio de longitud de onda.
Ilustración 2. Desplazamiento de Stokes.
1.2 Ley cuantitativa de la fluorescencia
Suponiendo que se tiene una muestra fluorescente de concentración C en la cual
se hace incidir una determinada radiación de intensidad I0. Parte
de la radiación incidente será absorbida por lamuestra y parte será
transmitida. La intensidad absorbida por la muestra será
IA = I0 - IT
I0 IF
IA
IT
Además, I0 e IT están relacionados por la ley de Lambert-Beer, donde la
relación entre ambos es exponencial y depende, no sólo de la concentración de
la muestra (C), si no de la cubeta utilizada (b = paso óptico) y del
coeficiente de absorción molecular (É›, depende de la λ y es
característico de la especie absorbente). T = I T/I0 = e-2.3É›bC → IA =
I0 (1- e-2.3ɛbC) La intensidad de la fluorescencia (IF) depende de tres
parámetros: - De IA (intensidad de absroción) - De k, que es función del
instrumento utilizado para tomar las medidas - De ɸF, que es el rendimiento
cuántico de fluorescencia, y se define como el número de fotones emitidos
frente al número de fotones absorbidos por unidad de tiempo. Este
parámetro toma valores comprendidos entre 0 y 1, siendo 0 para una molécula que
no emite fluorescencia y 1 para aquella que emita lo mismo que absorba.
Es un parámetro característico de cada molécula, no
depende de la longitud de onda de absorción ni de emisión.
n° fotones emitidos/t
Ley de Lambert-Beer:
IT = I0 (e-2.3ɛbC)
IF = k ɸF IA
ɸF =
n° fotones absorbidos/t
IF = k ɸF I0 (1- e-2.3É›bC) → Es una relación NO LINEAL Desarrollando el
término exponencial como una serie de McLaurin, se comprueba que si la
absorbancia (A= É›bC) es menor a 0’05, se pueden despreciar todos los términos
de la serie exceptuando el primero, de modo que: (1- e-2.3É›bC) ≈ 2’3É›bC
Introduciendo esta nueva relación en la ecuación de la intensidad fluorescente
se tiene una relación lineal.
IF = k ɸF I02’3É›bC →Relación LINEAL
1.3 Variables que afectan a la fluorescencia • Rendimiento cuántico꞉ El
rendimiento cuántico o la eficacia cuántica de la fluorescencia es simplemente
la relación entre el número de moléculas que emiten fluorescencia respecto al
número total de moléculas excitadas. Las moléculas altamente
fluorescentes, por ejemplo, la fluorisceína, tienen eficiencias cuánticas que,
en ciertas condiciones, se aproximan a la unidad. Las
especies no fluorescentes tienen eficiencias que son prácticamente cero.
• Estructura: La fluorescencia más intensa y la más útil es la que presentan
los compuestos que contienen grupos funcionales aromáticos (π→π*).
Los compuestos que contienen estructuras alifáticas y alicíclicas(o
heterocíclicas: n→π*) o estructuras con dobles enlaces muy
conjugados pueden presentar también fluorescencia. La mayoría de los
hidrocarburos aromáticos no sustituidos son fluorescentes en disolución, la
eficacia cuántica aumenta con el número de anillos y con su grado de conjugación(o grado de condensación). La sustitución en un anillo aromático causa desplazamientos en la longitud de
onda de absorción máxima y los cambios correspondientes en los picos de
fluorescencia. Además, la sustitución de halógenos también afecta la eficiencia
de la fluorescencia por el efecto del átomo pesado, que aumenta la probabilidad
para el cruce entre sistemas hacia el estado triplete, disminuyendo así la fluorescencia
de la molécula. • Rigidez estructural: Empíricamente se encuentra que la
fluorescencia está particularmente favorecida en moléculas que poseen
estructuras rígidas. Por ejemplo, las eficacias cuánticas
para elfluoreno y el bifenilo están próximas a 1'0 y 0'2, respectivamente, bajo
condiciones similares de medida. La influencia de la rigidez también
tiene importancia en el aumento de la fluorescencia de ciertos quelatantes
orgánicos cuando están formando un complejo con un ion
metálico. La falta de rigidez de la molécula provoca un
aumento de la velocidad de conversión interna y el correspondiente aumento en
la probabilidad de desactivación no radiante.
• Temperatura y disolvente: La eficacia cuántica de la fluorescencia disminuye
en muchas moléculas con el aumento de la temperatura, ya que el aumento de la
frecuencia de las colisiones a temperatura elevada hace aumentar la
probabilidad de desactivación no radiante (conversión externa). Una disminución
en la viscosidad del
disolvente también aumenta la probabilidad de conversión externa y produce el
mismo resultado. • Efecto del pH: La fluorescencia se ve muy afectada por la
influencia del
pH, ya que la emisión puede ser mayor o menor en un medio ácido o básico. La
fluorescencia de un compuesto aromático con
sustituyentes ácidos o básicos en el anillo depende normalmente del pH. Tanto la
longitud de onda como
la intensidad de emisión son diferentes para la forma ionizada y no ionizada del compuesto. Los
cambios en la emisión de los compuestos de este tipo
surgen del
distinto número de especies resonantes asociadas con las formas acidas y
básicas de las moléculas. Cuanto mayor es el número de formas resonantes, mayor
es la estabilidad del
primer estado excitado; la consecuencia es una fluorescencia en la región
ultravioleta. Por lo tanto, será muy frecuente en losmétodos fluorimétricos el
control estricto del
pH. La constante de disociación ácida para la molécula excitada difiere de la
constante de la misma especie en el estado fundamental. • Efecto de la
concentración: Cuando la concentración es suficientemente elevada como para que
la absorbancia multiplicada por 2'303 sea mayor que 0'05, no se pueden
despreciar los términos de la serie de McLaurin como se había hecho en el
apartado de rendimiento cuántico de fluorescencia y la linealidad se pierde;
entonces F toma un valor inferior al obtenido en la extrapolación de la línea
recta de la representación gráfica. Otros dos factores, responsables también de
las desviaciones negativas a elevadas concentraciones,
son la autoamortiguación y la autoabsorción. El primero es el
resultado de colisiones entre moléculas excitadas, a mayor concentración, mayor
probabilidad de choche y, por tanto, mayor transferencia de energía por vía no
radiante. La autoabsorción tiene lugar cuando la longitud de onda de
emisión se solapa con un pico de absorción, momento en
el cual la fluorescencia disminuye; porque la radiación emitida atraviesa la
disolución y es reabsorbida por otras moléculas fluorescentes.
• Efecto del oxígeno disuelto (Atenuador): Debido al paramagnetismo de la
molécula de oxígeno, ésta tiende a desactivar cualquier estado activado por
oxidación fotoquímica de la especie fotoluminiscente, provoca cruzamiento
intersistemas y conversiones de las moléculas excitadas al estado triplete, por
lo que es deseable que el oxígeno no se encuentra presente en solución o que su
concentración sea mínima. Un atenuador es una molécula
conpropiedades paramagnéticas que favorece el cruce intersistema (del estado singlete al
triplete). • Otras variables: Polaridad, potencial eléctrico, presión y enlaces
de hidrógeno.
2.
INSTRUMENTOS PARA LA MEDIDA DE LA FLUORESCENCIA Y LA
FOSFORESCENCIA
Los distintos componentes de los instrumentos para la medida de la
fotoluminiscencia son similares a los que se encuentran en los fotómetros o
espectrofotómetros UV-Vis. La ilustración 3 muestra la configuración
característica de los fluorímetros y los espectrofluorímetros. Los instrumentos de fluorescencia suelen emplear ópticas de doble
haz, muy útiles para compensar las fluctuaciones en la potencia de la fuente.
El haz de la muestra pasa primeramente a través de un
filtro (el instrumento recibe el nombre de fluorímetro) o un monocromador (se
trata entonces de un espectrofluorímetro) de excitación, que transmite la
radiación que provocará la fluorescencia limitando la longitud de onda de la
radiación fluorescente. La radiación fluorescente emitida por la muestra va a
propagarse en todas las direcciones, no obstante, lo más conveniente es tomar la
medida desde un ángulo de 90s con respecto al haz de excitación, ya que de ese
modo se evita que la dispersión producida por la disolución y las paredes de la
cubeta interfiera con la radiación emitida por la especie fluorescente,
provocando así grandes errores en la medida de la intensidad. La radiación
emitida llega a un fotodetector tras haber pasado
previamente por otro filtro o monocromador que ha aislado la fluorescencia para
su medida. A continuación
el haz de referencia pasa a través de un atenuador quereduce su potencia a,
aproximadamente, la radiación fluorescente. Las señales procedentes del
fotomultiplicador de la muestra y del
de referencia se dirigen a un amplificador diferencial cuya salida se visualiza
en un registro.
Ilustración 3. Componentes de un
fluorímetro o un espectrofluorímetro. El instrumento se compone de: • Fuente de
radiación luminosa: Generalmente se emplea una lámpara de descarga de xenón de alta potencia, la cual emite una intensa radiación
policromática continua en la región 240-1700 nm. El espectro de la lámpara es
parecido al de un cuerpo negro. También
pueden utilizarse láseres para medidas de fotoluminiscencia. • Sistema
de monocromación: También llamado selector de longitud de onda de excitación.
Se trata de un monocromador de red de difracción
(sencilla o doble). Se acompañan de rendijas de ancho variable con el fin de
actuar sobre la resolución y sensibilidad del análisis.
Además, con frecuencia se emplean filtros
de corte en el sistema óptico de emisión con el fin de impedir la entrada de la
intensa radiación de excitación en el monocromador de emisión. • Cubeta: Se
emplean tanto cubetas cilíndricas como rectangulares, de vidrio o de
sílice. En fluorescencia se utilizan celdas de vidrio común
cuando la radiación que se maneja es de rango visible. Para ultravioleta es
necesario utilizar sílice o cuarzo. Es importante el diseño del
compartimento de la cubeta, procurando que la dispersión de radiación sea
mínima. Así mismo, se debe evitar dejar huellas dactilares en las paredes, ya
que la grasa de la piel con frecuencia fluoresce. • Segundo sistema de
monocromación: Tambiénllamado selector de longitud de onda de emisión. Tiene
las mismas características que el de excitación: a cada monocromador le siguen
una rendija y un filtro respectivamente. • Detector:
Se coloca formando un ángulo de 90s con respecto a la fuente para evitar la
interferencia de la radiación de excitación y que mida sólo el espectro de
emisión, es decir, lo que ha absorbido la muestra. Por lo general se emplea un tubo fotomultiplicador, por la gran sensibilidad que
muestran estos dispositivos a bajos niveles de luz. • Sistema de amplificación
de la señal y lectura de la misma.
Calibrado del instrumento: Debido a las variaciones de la intensidad de la
fuente, de la sensibilidad del detector y de otras variables instrumentales, es
imposible obtener, a partir de un
espectrofluorímetro determinado, exactamente las mismas lecturas de un día para
otro para una disolución o un conjunto de disoluciones. Es una
práctica habitual calibrar el instrumento y ajustarlo al nivel de sensibilidad
reproducible. El calibrado suele llevarse a cabo con una disolución
patrón de un fluoróforo estable.
Características del método: Los métodos fluorescentes y fosforescentes son
aplicables a intervalos de concentración más bajos que en las medidas
espectrofotométricas de absorción y se encuentran entre las técnicas analíticas
más sensibles (los límites de detección son del orden de ppb).
La sensibilidad de un método fluorímetro puede
mejorarse aumentando la I0 mediante la amplificación adicional de la señal de
fluorescencia. Los métodos fluorimétricos tienen
sensibilidades que son de uno a tres órdenes de magnitud superiores a
loscorrespondientes de absorción. Debido a su elevada
sensibilidad pueden sufrir interferencias procedentes de la matriz de la
muestra. La precisión y exactitud son considerablemente buenas, aunque
más pobres que las de los procedimientos espectrofotométricos. La selectividad
que proporcionan los espectrofluorímetros es buena y, por ello, se utilizan
para investigaciones relacionadas con las características electrónicas y
estructurales de las moléculas.
Por tanto, se puede concluir que, en comparación con la absorción, las fuentes empleadas en fluorescencia son más potentes. Esto se
debe a que la energía emitida va a ser proporcional a
la intensidad de la fuente, mientras que en la absorbancia prácticamente es
independiente de tal intensidad. Como
consecuencia, los métodos de fluorescencia son de uno a tres órdenes de
magnitud más sensibles que los basados en absorción. Las lámparas de
arcos de xenón y xenón-mercurio, así como los láseres son fuentes de
fluorescencia habituales. Los monocromadores y transductores
suelen ser similares a los usados en espectrofotómetros de absorción. En
general, los instrumentos de fluorescencia son más costosos que los de
absorción a igual calidad. En el
caso de la fosforescencia, la instrumentación también es algo más complicada
que la dispuesta para la fluorescencia. Muchos
instrumentos de fluorescencia tienen incluidos los denominados fosforoscopios,
que permiten que estos mismos instrumentos puedan ser utilizados en medidas de
fosforescencia.
3. APLICACIONES DE LOS MÉTODOS FOTOLUMINISCENTES Los métodos fotoluminiscentes son
especialmente útiles en la detección y cuantificación deespecies debido a su
inherente sensibilidad. Cabe señalar la existencia de dos
aplicaciones de carácter general.
• Determinación de especies inorgánicas: Los métodos fluorimétricos de
determinación de especies inorgánicas pueden ser de dos tipos. Los métodos
directos, que implican la formación de un quelato fluorescente y la medida de
su emisión, y un segundo grupo, los métodos indirectos, que se basan en la
disminución de la fluorescencia que resulta de la acción atenuadora de la
sustancia que va a ser determinada. Esta última técnica ha
sido más ampliamente utilizada en la determinación de aniones. Existen
dos factores que limitan el número de iones de metales de transición que van a
dar lugar a quelatos fluorescentes: deben ser paramagnéticos y presentar muchos
niveles de energía poco espaciados. Los reactivos fluorimétricos que más éxito
tienen para el análisis de cationes son los que presentan estructuras
aromáticas con dos o más grupos funcionales dadores que permitan la formación
de quelatos con el ion metálico, como son la benzoína, el flavanol,
o la 8-Hydroxiquinolina. • Determinación de especies orgánicas y bioquímicas:
El número de aplicaciones del análisis fluorimétrico a
especies orgánicas y bioquímicas es muy elevado. Existen métodos para la
determinación de sustancias tales como enzimas, agentes medicinales
(quinina, fluoroquinolonas), productos naturales, esteroides, vitaminas
(vitamina A), hidrocarburos aromáticos policíclicos (antraceno, fenantreno),
aminoácidos (fenilalanina, triptófano), etc. Sin lugar a dudas, las
aplicaciones más importantes de la fluorimetría están en el campo del
análisis deproductos alimentarios, farmacéuticos, muestras clínicas y productos
naturales. La sensibilidad y selectividad del método lo hace
una herramienta particularmente valiosa en estos campos.
4. QUIMIOLUMINISCENCIA
La quimioluminiscencia se produce cuando una reacción química genera una
molécula excitada electrónicamente, la cual emite luz
conforme regresa al estado fundamental. Las reacciones de
quimioluminiscencia ocurren en diversos sistemas biológicos, donde el proceso
suele denominarse bioluminiscencia.
La sencillez de la instrumentación es una de las características más atractivas
de la quimioluminiscencia para aplicaciones analíticas. No se necesita una
fuente externa de radiación para fines de excitación, de modo que el
instrumento consistiría sólo en un vaso de reacción y
un tubo fotomultiplicador. En general, tampoco se requiere un
dispositivo de selección de longitud de onda, ya que la única fuente de
radiación es la reacción química. Los métodos de quimioluminiscencia se
caracterizan por su alta sensibilidad. Los límites de detección suelen variar de partes por millón a
partes por billón o menos. Las aplicaciones abarcan la determinación de
gases, como los óxidos
de nitrógeno, ozono y compuestos de azufre; determinación de especies
inorgánicas en fase liquida, como
el peróxido de hidrógeno y algunos iones metálicos; y análisis de especies
orgánicas.
BIBLIOGRAFÍA
Skoog, Douglas A Holler, F. James; Nieman, Timothy
A. ꞉ “Principios del
Análisis Instrumental”. V Edición. Ed.
Mc Graw Hill. 2001
Navarro Villoslada, Fernando. Seminario de Fluorescencia
Molecular. UCM. Diciembre
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