ITESM, Campus Qro.
Genetic Engineering Laboratory
Francisco Javier Ramírez Carbajal A00889696
November 13, 2011
Comparative Proteomics
Objectives
* Purify cytoskeletal proteins (actin and myosin) from five different fish samples and compare them with electrophoresis.
Introduction
Proteomics is known as “the study of an organism’s complete complement of proteins”, this means the study of all proteins, proteome, in order to know how they work in and outside the cells and understand the biological processes occurring in the organisms. This is a quite complex task because the number of proteins in an organism is huge, each gene can produce al least ten times as many proteins, and there are some genes that can code approximately 1,000 proteins.
Comparative proteomics is used to analyze the difference in the expression of proteins in different organisms or in different phases in an organism. In this experiment we will analyze the expression of two cytoskeletal proteins, actin (allows movement of cells and cellular processes) and myosin (has an important role in muscle contraction and is responsible for actin-based motility), by the use of SDS-PAGE.

Materials
* 5 1.5ml fliptop micro tubes.
*5 screwcap micro tubes.
* 250µl of Bio-Rad Laemmli sample buffer.
* 5 fish samples.
* 1x TGS electrophoresis buffer.
Equipment
* Mini-PROTEAN 3 cell
Methods
SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis), the way in which it work is the next, first the SDS that is a detergent denature the proteins in order to have proteins with only primary structure, this is done dissolving the hydrophobic molecules and then by the Sulfate the protein is covered with negatives charges that in the Electrophoresis Chamber will make the proteins will migrate towards the positive pole when the electrical field is placed.
By it side the PAGE will help to separate the proteins by size, if proteins were run in a normal gel all will cross it at the same speed, PAGE acts as a labyrinth that allow proteins cross over specific tunnels that have different sizes, so larger proteins stay at the top of the gel and the smaller ones go to the bottom and can be differentiated.
Protocol
1) Label five 1.5ml fliptop micro tubes, one for each fish sample.
2) Repeat the first step with screwcap micro tubes.
3) Add 250µl of Bio-Rad Laemmli sample buffer to each fliptop micro tube.
4) Cut a piecefrom each fish of 0.25 X 0.25 X 0.25 cm3.
5) Transfer each piece into a labeled fliptop micro test tube and close the lids.
6) Flick the microtubes 15 times.
7) Incubate for 5 minutes.
8) Transfer the buffer by puring from each fliptop microtube into a labeledsrewcap microtube.
*Do not transfer the fish.
9) Heat the samples in screwcap microtubes for 5 minutes at 95oC.
10) Set up Mix-PROTEAN 3 gel box.
2)Negando una donación se niega el derecho a la vida. El estado de Chile en su constitución nos asegura el derecho a la vida de cada persona, si se negara una donación de órganos sería vulnerar al estado. En nuestro país según información entregada por el ministerio de salud existen 1.186 persona esperando un Riñón, 130 un hígado, 9 un corazón, 45 un pulmón ; y adicional hay mas de 1000 personas en lista de espera por algún tejido. Adicional dependiendo de que el que necesite el tejido sea un menor de edad estaríamos acortando las posibilidades de que el país tenga a un trabajador mas, un médico, ingeniro o un chef, simplemente no se les daría la oportunidad de crecer.
3)No depende de la ley una donación de órganos sino de la educación que las personas recieben respecto al tema. Segun la corporación de donación de nuestro país las principales razones por las cuales las personas se niegan a donar tejidos es :
· Familias no conversan el tema12.7%
Miedo a no estar muerto 16.5%
Familias no respetan voluntad 14.6%
Tema religioso 5.1%
Desconfianza en el sistema sanitario 22.8%
No se les entrega información 28.5 %
Por consiguiente una persona en condiciones de ser donante es perdido regularmente por la poca información que la familia maneja del tema, perdiendo no solo una vida sino 2 , la del fallecido y de quien necesitaba el tejido.

4)Se puede beneficiar y mejorar la calidad de vida de mas de una persona. La esperanza de vida de una persona que necesite un órgano es baja de la promedio de quienes no lo necesitan. Es por esto que la calidad de vida se ve afectada, funciones basicas como orinar, comer , o caminar se vuelven una ardua labor no solo para el enfermo sino para su círculo familiar mas cercano. Ademas que el gasto monetario que para una familia promedio ( 2 padres , 2 hijos) un sueldo de 400.000 pesos significarían los gastos de una persona enferma de esta magnitud aumentarían considerablemente y su calidad de vida se vería afectada económica, social, psicológicamente. Por consiguiente una donación mejoraría considerablemente no solo el estado del paciente sino que de quienes lo rodean.

Contra Argumentación: Deben referirse a los argumentos presentados por la contra-parte, y no pueden agregar nuevos argumentos a favor de sus tesis.
Deben necesariamente improvisar a partir de lo expuesto por la contra-parte. No estapermitido hablar de memoria. También pueden optativamente contrarreplicar, cuando corresponda . Se deben tomar apuntes de la tesis contraria y refutarlas .

5) Conclusión:
Debe concluir la presentación del equipo. Luego debe resumir la presentación y mostrar porqué su equipo ha ganado, contrastando los argumentos propios con los contrarios, mostrando cuales y porqué han prevalecido.
En concluyente Chile es un país que si esta preparado para la donación de órganos , en donde se beneficiarían no solamente el modelo de familia en nuestro país, sino que tambien nos haríamos llamar realmente solidarios y en vias de desarrollo en donde cada persona ayuda a otra. El donar órganos es donar vida, si ésta se negase no solo infringiríamos a nuestra constitución sino que ademas los miles de enfermemos que aún tienen esperanza de un tejido estarían condenados a la agonia y posterior muerte. Para evitar esto debemos educar a la población desde que son pequeños hasta su avanzada edad.
El que el estado pague a los familiares por algo que mantendra vivo a otra persona generaría una deshumanización en todos , en donde realmente se lucraría mucho mas que con los privados, el que los órganos casi siempre vayan destinados a estratos 11) Add 1x TGS electrophoresis buffer to the chamber.
12) Prepare a Ready Gel cassette by cutting along the black line on the bottom of the cassette with a razor blade and pulling off the plastic strip, as indicated on gel cassette.
13) Remove the comb from the Ready Gel cassette.
14) Place Ready Gel cassette into the electrode assembly with the short plate facing inward. Place a buffer dam or another Ready Gel cassette on the opposite side of the electrode assembly, with notch on buffer dam facing inward.
15) Press down the electrode assembly while closing the two cam levers of the clamping frame.
16) Lower the inner chamber into the mini tank
17) Completely fill the inner chamber with 1X TGS electrophoresis buffer.
*Make sure the buffer covers the short plate
18) Fill mini tank approximatelywith 200ml of 1x TGS electrophoresis buffer.
19) Load the gel.
Lane 1 5 µl of Precision Plus Protein Kaleidoscope (Ladder
Lane 2 Error
Lane 3 10 µl of fish sample 1 (Salmon)
Lane 4 10 µl of fish sample 2 (Trucha)
Lane 5 10 µl of fish sample 3 (Mojarra)
Lane 6 10 µl of fish sample 4 (Calamar)
Lane 7 10 µl of fish sample 5 (Cazón)
Lane 8 10 µl of Actin and myosin standard
Data and Observations:
Electrophoresis couldn’t be realized successfully.
Calculations
There were no calculations in this experiment.
Conclusions:
As it was mentioned, electrophoresis couldn’t be done, we think is a problem in the function of the Electrophoresis Chamber, so what we obtained only was the purified proteins but we were unable to compare them.
References
Campbell, M. (2001). SDS-PAGE. Visited on November 13, 2011, in: https://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method/SDSPAGE/SDSPAGE.html
Groleau, R. (s. f.). Introduction to Proteomics. Visited on November 13, 2011, in: https://www.childrenshospital.org/cfapps/research/data_admin/Site602/mainpageS602P0.html
V. Childs, G. (2001). Actin Cytoskeleton. Visited on November 13, 2011, in: https://www.cytochemistry.net/cell-biology/actin_filaments_intro.htm