FOSFORILACIÓN OXIDATIVA. RESPIRACIONES

    Respiración es la obtención de energía por oxidación de sustratos reducidos DH2 (orgánicos en quimiorganotrofas, e inorgánicos en quimiolitotrofas), pero los coenzimas reducidos (ej., NADH) transfieren los electrones a un aceptor final oxidado, no directamente (como en la fermentación), sino a través de una cadena transportadora de electrones al final de la cual existeun aceptor exógeno oxidado (A), que se reduce.
Si el aceptor final es el O2, hablamos de respiración aerobia;
Si el aceptor final es distinto del O2 (nitrato, sulfato, etc.), respiración anaerobia.
En ambos casos, la transferencia se da ordenadamente, en la dirección de mayor potencial redox positivo, con la consiguiente liberación de energía libre. Como veremos enseguida, esta energía libre se va a traducir en un potencial electroquímico de protones, cuya disipación a través de ATP-asas de membrana origina ATP, conociéndose este proceso como fosforilación oxidativa.

1        CADENA TRANSPORTADORA DE ELECTRONES Y FUERZA MOTRIZ DE PROTONES
    Como el alumno seguramente sabrá, el mecanismo de la fosforilación oxidativa se suele explicar en base a la teoría quimiosmótica de Mitchell (1961 y años siguientes). Recordemos que la c.t.e. está formada por una serie ordenada de moléculas transportadoras situadas (en bacterias) en la membrana citoplásmica (y en sus invaginaciones), moléculas que sufren oxidaciones y reducciones reversibles.
    Los donadores de electrones inmediatos para las c.t.e son el FADH2 y el NADH+H+, que se generan, p.ej., en la glucolisis o en el ciclo de Krebs (ciclo de los ácidos tricarboxílicos o del ácido cítrico). El alumno conocerá por la asignatura de Bioquímica los principales tipos de componentes de las c.t.e. respiratorias:
NADH deshidrogenasas, unidas a la cara interna de la membrana. Aceptan átomos de H a partir del NADH, y se los ceden a las flavoproteínas
Flavoproteínas (Fp, un tipo de riboflainas), dotadas de gruposFAD o FMN. Pueden acepar átomos de H, pero a su vez cedenelectrones.
Proteínas no hémicas de Fe-S (Fe/S proteínas). Algunas poseen agrupamientos de Fe2S2 (como la ferredoxina) y otras Fe4S4. Transportan solamente electrones.
Quinonas. Son moléculas muy hidrofóbicas, inmersas en la membrana, capaces de moverse dentro de ella. Sirven como aceptores de átomos de H, pero sólo ceden electrones. En bacterias podemos encontrar dos principales tipos de quinonas: ubiquinona (UQ)
menaquinona (MQ), más frecuente en bacterias Gram-positivas.

Citocromos (proteínas hémicas con Fe quelado). Sufren oxidación y reducción por pérdida y ganancia de un electrón cada vez, a través del Fe del centro de la molécula. Los citocromos son de varias clases, según el tipo de grupo hemo (ej. tipo a, b, c, etc), y a veces forman complejos fuertes con otros citocromos (ej., cit bc1) o con Fe/S-proteínas.
    El alumno recordará que los electrones fluyen desde los transportadores con potencial de reducción más negativo hacia los de potencial más positivo, hasta que finalmente reducen un aceptor final de electrones (A) obtenido del ambiente. Observar que algunos de estos transportadores transportan átomos de H (o sea, protones y electrones), mientras que otros transportan únicamente electrones. sQué pasa con los protones? Ahí está la gracia paciencia, enseguida lo veremos. La situación de los transportadores dentro de la membrana es asimétrica, lo que condiciona que el transporte sea un proceso vectorial (es decir, tiene un sentido determinado), de modo que los H salen haciaafuera y los electrones tienden a entrar al interior.   Como resultado de todo ello, tenemos que existen determinados puntos de la c.t.e. (llamados bucles o lazos translocadores de protones) en los que el efecto neto es la salida de protones al exterior de la membrana citoplásmica(concretamente, en los puntos donde confluyen un transportador de H+ y otro de electrones). Es decir, existe una translocación de protones hacia el exterior ligada a las reacciones redox que ocurren en la c.t.e.
    Por otro lado, la membrana es impermeable a los protones, por lo que los protones translocados a resultas del funcionamiento de las c.t.e. no pueden entrar directamente. Por lo tanto, se crea un gradiente electroquímico de protones, compuesto de gradiente osmótico de esos iones H+ (pH) y un gradiente de carga eléctrica (). Este gradiente es una forma de energía potencial que puede realizar trabajo. El valor de este gradiente electroquímico de protones o fuerza protón motriz (f.p.m.) es:
 ï„p = ï„ -Z·ï„pH (expresado en milivoltios, mV),
donde Z = 2,3 R·T/F, siendo R= constante de los gases, T= temperatura absoluta, F= constante de Faraday
Como ya dijimos, esta ï„p (f.p.m.) es capaz de:
realizar trabajo útil directamente: transporte activo ligado a simporte de iones (repasa el capítulo 6)
rotación del motor flagelar (repasa el capítulo 8)

usarse para dirigir la formación de enlaces fosfato de alta energía en forma de ATP (fosforilación oxidativa), como veremos a continuación.
2        MECANISMO DE LA ATP-SINTASA DEPENDIENTE DE PROTONES
            La conversión de lafuerza protón-motriz en ATP se realiza por medio de una ATP-asa. Este complejo proteico consta de dos partes funcionales, un canal integral de membrana (F0) y una estructura globular en el lado citoplásmico de la membrana (F1). La ATP-asa funciona de modo reversible, como ATP-sintasa y como ATP-hidrolasa. La disipación de la fuerza protón motriz supone el funcionamiento como ATP-sintasa, según el siguiente modelo:
F0 es un complejo integral de membrana, que trasloca los protones. Está compuesto de . La subunidad a es la encargada de canalizar los protones a través de la membrana, mientras que las dos subunidades b sobresalen hacia el lado citoplásmico, interaccionando con la F1. Las 12 subunidades de c se disponen formando una especie de cilindro transmembranoso, capaz de rotar en ambos sentidos.
F1 constituye la porción intracitoplasmática, dotada de los sitios catalíticos. Su composición se puede expresar como {ït3, ï¢3, ï§, ï€, ï¥). La parte más saliente de F1 consta de 3 subunidades ït alternando con 3 subunidades ï¢.
Al parecer, la traslocación de unos 3 o 4 protones a través de F0 está acoplada, por medio de grandes cambios conformacionales, a la síntesis de una molécula de ATP en las subunidades ï¢ de la F1, por un notable mecanismo de catálisis rotacional: El que los 3-4 protones entren por F0 (probablemente a través de la proteína a) provoca la rotación del cilindro de c12, lo que supone una torsión que se transmite a la F1 a través de las proteínas ï§ï¥. lo que a su vez provoca un cambio conformacional en las subunidades ï¢.
El cambio conformacional en lassubunidades ï¢ permite que a ellas se una ADP y Pi. El trabajo realizado por el sistema se usa para producir entonces el ATP, volviendo las ï¢ a su configuración original, preparadas para un nuevo ciclo de síntesis de ATP.
La función de b2 es equivalente a la del estator del motor: sirven para evitar que las ït y ï¢ se muevan cuando se produce la torsión de ï§ï¥.

 
 ATP-sintasa de E. coli, el más pequeño motor rotatorio del mundo vivo
    Las ATP-sintasas son los motores rotatorios más pequeños del mundo vivo (más pequeños que el motor del flagelo bacteriano). Las ATP-asas de membrana pueden funcionar también en sentido inverso al de síntesis, es decir, como ATP-hidrolasas: se produce hidrólisis de ATP y extrusión de protones al exterior. Por lo tanto, en este sentido de funcionamiento, se genera un gradiente de protones a expensas de gasto de ATP intracelular. Esto muestra una vez más que el ATP y el gradiente de protones se pueden considerar como formas diferentes e interconvertibles de energía celular.
    Las ATP-asas productoras de gradientes de protones existen en bacterias no respiratorias, que carecen de c.t.e., como por ejemplo, las bacterias anaerobias del ácido láctico. Estas bacterias obtienen su ATP por fosforilación a nivel de sustrato, en sus procesos de fermentación. Pero al igual que otras bacterias, necesitan realizar procesos de transporte activo ligado a simporte de protones y pueden moverse por flagelos, por lo que necesitan también crear un gradiente de protones para estos fines. En estas bacterias las ATPasas funcionan siempre comoATP-hidrolasas, conviertiendo parte del ATP obtenido por fermentación en una fuerza protón-motriz que se usa para transporte de nutrientes y para alimentar al motor flagelar.
3        DIVERSIDAD DE LAS RESPIRACIONES
3.1    SEGÚN LOS TIPOS DE DONADORES DE ELECTRONES
3.1.1    QUIMIORGANOTROFÍA
            Los organismos que “respiran” una fuente orgánica de electrones se denominan quimiorganotrofos. En ellos, la oxidación de la fuente orgánica de carbono no solo sirve como donante de electrones para la fosforilación oxidativa, sino que también sirve para generar intermediarios metabólicos que serán usados para las reacciones biosintéticas. Por ejemplo, tanto la ruta glucolítica como el ciclo del ácido cítrico producen intermediarios (como α-cetoglutarato y oxalacetato en el ciclo de Krebs) que, llegado el caso son “retirados” del ciclo y usados como precursores de biosíntesis. La diversidad de fuentes de carbono orgánico que pueden usar los procariotas organotrofos respiradores es asombrosa (aludiremos a ello en el capítulo próximo, cuando tratemos el carbono como nutriente).
3.1.2    QUIMIOLITOTROFÍA
            En los quimiolitotrofos, el donador de electrones es una molécula inorgánica reducida. Esta capacidad de obtener energía por fosforilación oxidativa a partir de donadores inorgánicos de electrones sólo ha evolucionado en ciertos grupos de procariotas. Los quimiolitotrofos se pueden clasificar en grupos fisiológicos según el tipo de donador inorgánico que “respiran”:
Los quimiolitotrofos “típicos”, son por lo general respiradores aerobios, o sea, el aceptor final deelectrones es el oxígeno molecular. Son de varios tipos según la clase de donante inorgánico de electrones que oxidan: bacterias oxidadoras de hidrógeno (oxidan el H2 hasta H2O)
bacterias oxidadoras del hierro ferrroso (pasan Fe2+ a férrico, Fe3+)
bacterias oxidadoras de azufre reducido: de sulfuros (S2-) y azufre elemental (S0). La oxidación total de este azufre reducido conduce a la producción de ácido sulfúrico (SO4H2)
bacterias nitrificantes, con dos subtipos diferentes: las oxidadoras de amoniaco (llamadas nitrosas, que respiran NH3 para convertirlo en NO2-)
las oxidadoras del nitrito (llamadas nítricas, que respiran NO2- para convertirlo en NO3-)


Recientemente se ha descubierto un nuevo tipo de quimiolitotrofos, que acoplan en anaerobiosis la oxidación del amoniaco con la reducción de los nitritos, produciendo nitrógeno molecular y agua (NH4+ + NO2- ïƒ  N2 + 2 H2O). Este proceso ha recibido el nombre deoxidación anaerobia del amoniaco (anammox en su abreviatura inglesa, que fácilmente podemos traducir como oxanam en abreviatura castellana, desgraciadamente poco usada).
Las bacterias anammox (como Brocadia anammoxidans) son miembros del phylum de los Planctomicetos, un fascinante grupo de eubacterias con paredes proteicas (sin peptidoglucano), y citoplasma dividido en compartimentos mediante membranas especiales. (Recuerda que decíamos en el capítulo 7 que estas bacterias, a diferencia de las demás, pueden llevar el nucleoide rodeado de membranas). El género Brocadia posee un orgánulo rodeado de este tipo especial de membrana, denominadoanamoxisoma, donde tiene lugar esta reacción anammox. El descubrimiento de este proceso ha supuesto una revisión de nuestras ideas tradicionales sobre el ciclo del nitrógeno en la naturaleza (antes se pensaba que el amoniaco era estable en anaerobiosis), y puede tener secuelas prácticas en el campo de la protección ambiental, ya que se han diseñado procesos industriales para eliminar anóxicamente el amoniaco y las aminas de las aguas residuales.
            El mecanismo de generación de ATP en quimiolitotrofos es similar al de quimioorganotrofos respiradores: los electrones extraídos del donador exógeno (en este caso inorgánico) pasan a una cadena transportadora de electrones hasta un aceptor final (que suele ser el oxígeno en los litotrofos típicos, y que es nitrito en los anammox), generando una fuerza protón-motriz que se transforma en ATP por ATP-sintasas. 
            Pero a excepción del H2, los demás donadores inorgánicos de electrones tienen un potencial de reducción E0’ menor que el del NADH, por lo que la oxidación de estos donadores inorgánicos sólo puede generar energía, pero no poder reductor de modo directo. Para obtener poder reductor emplean transporte inverso de electrones: parte del gradiente electroquímico creado durante la respiración se emplea en hacer que electrones viajen por la cadena transportadora de electrones (o una parte de ella) en sentido inverso, para poder reducir el NAD+.
            Obviamente, los quimiolitotrofos, a diferencia de los quimiorganotrofos, no pueden usar el donador de electrones como fuente de carbono. La mayor parte de los quimiolitotrofos recurrena fijar CO2 de la atmósfera, es decir, son también autotrofos. Para reunir estas dos características se usa el nombre de quimiolitoautotrofos. La fijación del carbónico por parte de las eubacterias litoautotrofas “típicas” se realiza por el ciclo de Calvin, y disponen de reservas de RuBisCo (carboxisomas, estudiados en el tema 7). Las bacterias anammox son también autotrofas aunque carecen de ciclo de Calvin, y aún se desconoce el mecanismo de fijación del CO2.
3.2    SEGÚN LOS TIPOS DE ACEPTORES DE ELECTRONES
3.2.1    RESPIRACIÓN AEROBIA
            En la respiración aerobia el oxígeno molecular se usa como sumidero de los electrones procedentes de la cadena transportadora, y junto con protones se reduce hasta agua (œ O2 + 2 ee + 2 H+ ïƒ  H2O). Esos protones proceden de la previa disociación del agua (H2O ïƒ  H+ + OH-), por lo que la oxidación del agua deja el lado citoplásmico de la membrana con pH alcalino y cargado negativamente; mientras tanto, como hemos visto, el funcionamiento de la cadena de transporte de electrones deja el lado externo o periplásmico de la membrana cargado positivamente y ácido).
3.2.2    RESPIRACIONES ANAEROBIAS
    Como ya hemos dicho, en algunas bacterias, al final de la c.t.e. puede existir un aceptor diferente del oxígeno (respiración anaerobia). Los aceptores y sus respectivos productos reducidos (A ïƒ  AH2) son:
Aceptor ïƒ  prod. reducido Procariotas (Ejemplos)
NO3- ïƒ  NO2- N2 Pseudomonas, Bacillus
NO3- ïƒ  NO2- Enterobacterias
SO42- ïƒ  S0 SH2 Sulfatorreductoras (Desulfovibrio, Desulfotomaculum)
fumarato ïƒ  succinato Enterobacterias
CO2 ïƒ  CH4 Arqueas metanogénicas
Fe3+ ïƒ  Fe2+ Shewanella, Geobacter
     Con estos aceptores se obtiene menos energía que con el oxígeno, porque la pareja O2/H2O es más oxidante que las otras. Algunos de estos procariotas son respiradores estrictamente anaerobios (caso de las arqueas metanógenas y de las bacterias sulfatorreductoras). Otros pueden alternar entre respiración aerobia y anaerobia, dependiendo de la disponibilidad de los correspondientes aceptores (caso de las bacterias que usan nitratos como aceptores). Y adicionalmente, existen bacterias como las enterobacterias que aparte de tener respiración aerobia y anaerobia (en este caso usando nitratos) pueden usar igualmente metabolismo fermentativo (en anaerobiosis y en ausencia de aceptores de electrones para sus cadenas respiratorias).
    El uso de nitratos, sulfatos y CO2 como aceptores finales de electrones (y no como material a incorporar al metabolismo plástico) se denomina metabolismo disimilativo (o desasimilativo). para distinguirlo del asimilativo (nutricional). El producto reducido se excreta al ambiente de la bacteria.
    El uso disimilativo de nitrato se llama desnitrificación, y ocurre por medio de una serie de fases donde el N va cambiando su estado de oxidación:
 NO3- NO2- (nitrito) ïƒ  NO (óxido nítrico) ïƒ N2O (óx. nitroso) ïƒ  N2 (dinitrógeno)
Los tres últimos son gases y pueden escapar a la atmósfera. Las enzimas que catalizan esta ruta son reprimidas por el oxígeno molecular y se inducen (en ausencia de oxígeno) por el nitrato:
 La reducción disimilativa denitrato hasta nitrito se lleva a cabo por la nitrato-reductasa disimilatoria, que viene a ejercer un papel semejante al citocromo terminal (citocromo-oxidasa) de muchas cadenas que usan oxígeno molecular como aceptor. Es de localización intramembranosa.
En las bacterias Gram-negativas la nitrito-reductasa es de localización periplásmica. Las nitrito-reductasas de Pseudomonas constan de citocromos c+d1.
La óxido nítrico-reductasa (que cataliza el paso NO ïƒ  N2O) es un complejo de citocromo b+c integral de membrana.
 La óxido nitroso-reductasa (que cataliza el paso N2O ïƒ N2) es una enzima de localización periplásmica.
Hasta la llegada de las actividades industriales humanas, todo el dinitrógeno (N2) de la atmósfera procedía de estos procesos desnitrificantes.
            El uso disimilatorio del sulfato (es decir, como aceptor de electrones en respiraciones) solamente ha evolucionado en el grupo de las bacterias sulfatorredutoras (ej.: Desulfovibrio, Desulfotomaculum). Para que el sulfato (SO42-) pueda recibir los electrones, primero se tiene que “activar” con ATP (mediante la ATP-sulfurilasa), formándose la adenosina-fosfo-sulfato (APS). La parte sulfato de la APS recibe dos primeros electrones y se reduce (por la APS-reductasa) hasta sulfito (SO32-), con liberación de AMP. Luego el sulfito es reducido (aceptando otros seis electrones) hasta sulfuro (S2-) mediante la sulfito-reductasa. La mayoría de sulfatorreductoras son quimiorganotrofos, pero algunos pueden usar también H2 como donador de electrones (quimiolitotrofos).
    Las arqueas metanogénicas son los únicosseres vivos capaces de obtener energía acoplando la oxidación del hidrógeno molecular con el uso de CO2 como aceptor de electrones (actuando en estas condiciones como quimiolitotrofos):
4H2 + CO2 ïƒ  CH4 + 2H2O
Además, algunas metanógenas no solo son litotrofas, sino que igualmente fijan autotróficamente el carbónico, aunque por rutas especiales diferentes al ciclo de Calvin.
            El hierro férrico (Fe3+) puede ser usado en la naturaleza como aceptor de electrones por parte de ciertas bacterias quimiorganotrofas (Shewanella putrefaciens) y quimiolitotrofas (Geobacter metallireducens es litotrofo facultativo: puede usar como donador de electrones el hidrógeno molecular y compuestos orgánicos sencillos).
Otros aceptores inorgánicos de electrones:
El manganeso mangánico (Mn4+) puede ser reducido por algunas bacterias, como la ya citada Shewanella putrefaciens cuando crecen respirando acetato y otros sustratos orgánicos.
 El clorato (ClO3-)
El selenato (SeO42-) se puede reducir a selenito (SeO32-) y posteriormente a selenio metálico (Se0). Se ha aprovechado esta reacción para descontaminar aguas que llevaban estos compuestos tóxicos (biorremedio).
El arseniato (AsO42-) es un compuesto muy tóxico, y puede ser reducido junto con el sulfato por la bacteria sulfatorreductora Desulfotomaculum, formándose un complejo mineral de arsénico y sulfuro (trisulfuro de arsenio, As2S3), que precipita. Este ejemplo de biomineralización se está intentando aprovechar para detoxificar suelos y aguas contaminados.
3.3    DIVERSIDAD DE CADENAS TRANSPORTADORAS
            Elestudiante seguramente conocerá por otras asignaturas la cadena de transporte electrónico de las mitocondrias. Pues bien, en bacterias existe una gran diversidad de tipos de cadenas transportadoras de electrones, si bien en todos los casos aparecen los elementos que citamos más arriba (flavoproteínas, Fe/S-proteínas, quinonas, citocromos). La cadena sigue el orden derivado de la torre de electrones (desde los componentes más electronegativos a los menos electronegativos o más electropositivos) y se da una alternancia entre transportadores de átomos de hidrógeno (protones y electrones) y de sólo electrones (es decir, aparecen bucles translocadores de protones hacia fuera, lo que genera la fuerza protón-motriz).
La c.t.e. de Paracoccus, una bacteria que posee un sistema similar al de las mitocondrias (Fp --> FeS proteína --> quinona -->  cit bc --> cit c -->  cit aa3 --> O2), donde se observan 3 sitios donde termodinámicamente la variación de energía libre es suficiente para apoyar la síntesis de una molécula de ATP en cada uno.
            La cadena transportadora de electrones de Paracoccus cuando usa oxígeno como aceptor final es similar a la de las mitocondrias (Fpà FeS proteína à quinona (coenzima Q) à cit bc1 à cit c à cit aa3 àO2), y en ella se observan tres sitios donde termodinámicamente la variación de energía libre es suficiente para apoyar la síntesis de una molécula de ATP.
            Muchas cadenas respiradoras aerobias muestran ramificaciones alternativas, sobre todo a nivel de los citocromos terminales. El papel principal de estas ramificaciones es lograrflexibilidad en la ruta de transferencia de electrones, de manera que se obtengan rendimientos máximos en ciertos sustratos y condiciones de crecimiento, y para minimizar los efectos nocivos de otros.
P. ej., si E. coli dispone de oxígeno lo usará como aceptor final de electrones, pero dependiendo de su concentración recurrirá a una u otra rama. (A su vez, esto puede estar relacionado con la fase de crecimiento: en la fase exponencial, cuando hay todavía suficiente nivel de O2, se usa una rama, mientras que en fase estacionaria, cuando el nivel de O2 ha bajado, se usa la otra).
El mismo E. coli y otras bacterias anaerobias facultativas, en un ambiente sin oxígeno pero con presencia de nitratos puede usar estos aceptores alternativos con las correspondientes variantes en los citocromos terminales.
Cuando Azotobacter (fijador aerobio de N2) crece fijando nitrógeno molecular, usa una ramificación que gasta muchísimo oxígeno como aceptor final (aunque el rendimiento en ATP es menor); con ello logra evitar que el oxígeno pase al citoplasma, con lo que protege a la nitrogenasa de la inactivación por oxígeno.
            En los quimiolitotrofos, cuando el donador de electrones es diferente al hidrógeno molecular, la cadena transportadora de electrones funciona en los dos sentidos:
en su sentido “normal”, ya estudiado. Un donador inorgánico de electrones cede electrones, que llegan a la cadena transportadora de electrones, que crea un gradiente de protones, cuya disipación a través de ATP-asa genera ATP; Sin embargo, salvo en caso de usar H2, los donadores exógenos no sirven paragenerar poder reductor (coenzimas reducidas);
pero estas bacterias necesitan equivalentes de reducción (NADPH) para reducir el CO2 (su fuente exclusiva de C) hasta material orgánico celular [CH2O]. Este NADPH lo logran merced a un flujo invertido de electrones a través de la cadena transportadora de electrones, usando para ello como energía parte del potencial de protones (f.p.m.) generado por el flujo normal.