La cromatografía es una técnica separativa empleada para separar los componentes de una mezcla y como criterio de pureza e identificación en algunos casos. Se basa en un principio de distribución de un componente entre dos fases: una móvil que fluye a través de una fase fija o estacionaria.
Dentro de las cromatografías de adsorción tenemos a la ya conocida C.C.D. (cromatografía en capa delgada) la cual sera utilizada en este trabajo como criterio de identificación y pureza; y la cromatografía en columna. Esta última se emplea para separaciones a escala preparativa ya que permite trabajar con gramos de muestra.
La columna tiene como ventaja sobre la C.C.P. (cromatografía en capa preparativa)el hecho de contar con dos nuevas variables separativas: 1) el cambio secuencial de polaridad del solvente de elusión, 2) el desplazamiento ilimitado del frente del solvente.

En el siguiente trabajo se utilizara la técnica de cromatografía de adsorción en columna para separar pigmentos naturales.

Los pigmentos naturales pueden agruparse según tres tipos fundamentales de estructuras
1. Porfirinas: Son derivados de la estructura porfirínica, que consiste en cuatro anillos pirrólicos heterocíclicos (conteniendo N) unidos por cuatro grupos metileno, formando un sistema total con dobles enlaces conjugados. Un tipo de porfirinas son las clorofilas (verdes) presentes en todos los organismos fotosintéticos.
2. Carotenoides: Son terpenos o derivados terpénicoscoloreados, formados por combinación de isopreno con dobles ligaduras conjugadas. Un tipo de carotenoides son los carotenos que contribuyen en gran medida al conjunto de colores de los vegetales.
3. Flavonoides: Son aquellos que presentan como unidad estructural. Un tipo de flavonoides son las flavonas.

Objetivo
Lograr el manejo de la técnica cromatografica de adsorción, aplicandola a la separación de pigmentos naturales.

Desarrollo
A. Extracción de los pigmentos de hojas verdes (espinaca y acelga
1. Se trituran las hojas en la licuadora con etanol.
2. Filtrado con algodón y posteriormente con papel de filtro para retirar residuos muy pequeños.
3. Extracción con acetato de etilo.
4. Evaporación en rotavap.

B. C.C.D. del extracto de pigmentos
1. Analisis del número de componentes del extracto por C.C.D
2. Búsqueda de la secuencia de solventes a utilizar para la realización de la cromatografía de columna.

C. Separación de los componentes del extracto por cromatografía de columna
1. Preparación de la columna.
• Se arma la columna como lo indica la figura 3 de la guía de laboratorio, sólo que dejamos su extremo superior sin cubrir para que se pueda aplicar presión y de este modo acelerar la corrida.
• Se introduce un pequeño trozo de algodón que se lo empuja hasta el final de la columna con una varilla de vidrio alargada.
• Se humedece el algodón con el solvente de armado (que se elegira acontinuación) y se lo apisona.
• Se vuelca el solvente hasta completar cierta medida.
• Se arma una suspensión con 7g. de sílica y el solvente de armado (en un recipiente aparte), y a esta mezcla se la vuelca en la columna.
• Se abre el robinete para que comience a drenar el solvente y se acomode el adsorbente. Se deja fluir hasta que se acabe el volumen de solvente (nunca se deja secar el adsorbente del todo).
• Se siembra el extracto.
• Se vuelca con suavidad el primer solvente de elusión.
• A medida que desciende la muestra sembrada sobre el adsorbente, se va recogiendo el líquido en tubos de ensayo.
2. Desarrollo de la cromatografía con posterior analisis de las fracciones obtenidas por C.C.D.

D. Realización del espectro U.V. de carotenos y clorofilas

Resultados
B. C.C.D. del extracto de pigmentos









De la observación de las C.C.D se deduce que hay al menos, tres compuestos identificables en la muestra.

Para el revelado de las placas se utiliza luz UV, si embargo por tratarse de pigmentos, las manchas pueden visualizarse a simple vista.

Secuencia de solventes a utilizar
1º Hex:AcOEt (98:2) Para eluir los compuestos de color amarillo
2º Hex:AcOEt (9:1) Para eluir el resto de los compuestos amarillos y la franja de color gris
3º Hex:AcOEt (1:1) Para eluir los compuestos de coloración verde y otros de color amarillento

Como solvente de armado se utilizó éter de petróleo puro (cuya polaridad es analoga a la delhexano). Se debe tener en cuenta que el solvente de armado debe ser de una polaridad igual o inferior al primer eluyente.

C. Separación de los componentes del extracto por cromatografía de columna
Se extrajeron 5 tubos. El primero correspondiente a la elusión de una banda de coloración amarillenta. Luego se recogieron tres tubos que contenían la elusión correspondiente a una banda de color gris. Los ayudantes de turno nos advirtieron que existe muy poco conocimiento sobre la naturaleza de estos compuestos. Por lo tanto, los tubos de esta fracción fueron descartados y no se cromatografiaron por C.C.D. En el quinto tubo se recogió la elusión correspondiente a la franja de color verde. Y por último, se recogió la elusión correspondiente a la última franja de color amarilla.
El contenido de cada tubo se llevó al rotavap con el fin de eliminar el exceso de solvente y obtener cada fracción mas pura para su posterior analisis por C.C.D.

Analisis por C.C.D. de las fracciones obtenidas
Como no se halló una mezcla de solventes capaz de separar considerablemente los compuestos, ya que si se utilizaba una mezcla muy poco polar con el fin de obtener Rfs distanciados para los compuestos de color amarillento y otro mas oscuros, la mancha de color verde no corría mas alla del origen. Por el contrario, si se usaban solventes mas polares para que la mancha verde pudiera ser desplazada del origen, los de menor polaridad eran arrastrados con el frente. Es por estoque se decidió dividirnos en grupos y que cada uno probara con 1 solvente (distinto al de los demas grupos) hasta que alguno diera con el adecuado. En mi caso, se utilizó la mezcla Hex:AcOEt (96:4). Ésta resultó dar un buen desplazamiento para los compuestos de coloración amarillenta pero no se logró que corriera la mancha verde del origen de siembra

D. Realización del espectro U.V.
Se realizó el espectro U.V. de cada fracción obtenida. Los graficos no fueron guardados.

Discusión
B. C.C.D. del extracto de pigmentos
Sabiendo que en el extracto se encontraban presentes compuestos carotenoides, flavonoides y clorofílicos y conociendo las estructuras basicas de los mismos, se pudo identificar a éstos en las placas. Otro indicador de la identidad de cada compuesto es su coloración típica. De este modo, inferimos que las manchas retenidas en el origen pertenecen a las clorofilas (de color verde) y a los flavonoides (color amarillento). De modo que los compuestos que mas corrieron se tratarían de carotenoides. Esto es mas facil de comprender si se observan las estructuras de estos compuestos.

























La estructura de la clorofila es claramente la mas compleja. Su gran tamaño y forma, a demas de la presencia de grupos polares, es el motivo por el cual esta molécula no corre con solventes poco polares y queda retenida en el origen de siembra. Los carotenos, al estar formados por unidades de isoprenocon dobles ligaduras conjugada, como el β – caroteno, son los menos polares y por ende los que menos se desplazan. En los flavonoides, si bien su estructura basica es no polar, a menudo sus cadenas se encuentran cicladas por atomos de oxígeno, como en los ejemplos dados, esto les confiere cierta polaridad que provoca su adsorción en la sílica y por consiguiente, menor desplazamiento.

Finalmente, identificamos lo obtenido en la elusión de cada franja de la columna:

Tubo 1: Elusión de la franja amarilla: Carotenos
Tubo 2,3,4: Elusión de la franja gris: Sustancias desconocidas
Tubo 5: Elusión de la franja verde: Clorofilas
Tubo 6: Elusión de la segunda franja amarilla: Flavonoides

C. Analisis por C.C.D. de las fracciones obtenidas
Como se explicó anteriormente, no se halló el o la mezcla de solventes apropiada como para obtener manchas lo suficientemente separadas unas de otras y sin que alguna de éstas fuera retenida en el origen o corriera con el frente. Por lo tanto, no se pudo comprobar la pureza de cada fracción aunque si la obtención de los compuestos en cada una de ellas.

D. Realización del espectro U.V.
A través del espectro de U.V. se pudo comprobar la correcta separación de los compuestos, hecho que no pudo demostrarse por C.C.D.

Conclusiones
Se concluye que la técnica de cromatografía en columna es un buen método para obtener la separación de los compuestos de una mezcla en grandes cantidades (en este caso, loscomponente de un extracto vegetal). Si bien esto es cierto, hay que tener presente que en caso de poseer compuestos muy similares en la muestra, la resolución de la columna puede resultar poco favorable y en tales casos probablemente sea necesario el empleo de otra técnica para conseguir dicha separación.
Por otro lado, se pudo comprender la utilidad de la técnica de C.C.D. para la elección de los solventes de cada etapa de la experiencia, así como también, fue utilizado como criterio de identificación y pureza de las fracciones obtenidas.
Por último, el espectro de U.V. confirmó la obtención y pureza de los compuestos extraídos.


Toxicidades
Compuesto Inhalación Piel Ojos Ingestión
EtOH Tos, somnolencia, dolor de cabeza, fatiga. Piel seca. Enrojecimiento, dolor, sensación de quemazón. Sensación de quemazón, confusión, vértigo, dolor de cabeza, pérdida del conocimiento.
Hexano Vértigo, somnolencia, dolor de cabeza, dificultad respiratoria, nauseas, debilidad, pérdida del conocimiento. Piel seca, enrojecimiento. Enrojecimiento, dolor. Dolor abdominal.
AcOEt Tos, vértigo, somnolencia, dolor de cabeza, nausea, jadeo, dolor de garganta, pérdida de conocimiento, debilidad. Enrojecimiento, dolor. Enrojecimiento, dolor. Dolor abdominal, vértigo, nausea, dolor de garganta, debilidad.
MeOH Tos, vértigo, dolor de cabeza, nauseas. ¡PUEDE ABSORBERSE! Piel seca, enrojecimiento. Enrojecimiento, dolor. Dolor abdominal, jadeo, pérdida del conocimiento, vómitos.