PIGMENTOS FOTOSINTÉTICOS




PALABRAS CLAVES

Pigmentos, absorbancia, carotenos, xantofilas, clorofilas, espectro de luz, propiedades, plantas verdes.

RESUMEN

Se extrajeron los pigmentos de hojas de espinaca (spinacia sp.) y se lograron identificar por medio de la cromatografía de papel; por este método se encontró que la migración de los carotenoides fue mayor a la de las clorofilas debido a su mayor afinidad por los disolventes organicos, con resultados de Rfs: 0.19; 0.35; 0.59; y 0.77 para la clorofila b, la clorofila a, las xantofilas y los carotenos, respectivamente. Posteriormente se separaron los pigmentos en medio líquido, para lo cual se utilizaron disolventes de diferente polaridad. Al realizar la técnica de espectrofotometría se observó que en los carotenos la mayor absorbancia se presenta de los 420 a 480 nm. En las clorofilas se presentan dos rangos de maxima absorbancia: entre 400 – 480 nm y entre 580 -660 nm; y una gran zona muerta entre 500- 560 nm. Finalmente la observación del extracto original diluido de espinaca en el espectroscopio reveló una banda con los colores del espectro de luz visible, exceptuando el violeta y el azul oscuro. Estas observaciones corresponden a las longitudes de onda de los 480 a los 680nm aproximadamente. Después de los 700nm se observa una banda roja, resultado de la fluorescencia.

ABSTRACT

The pigments extracted from spinach leaves themselves (spinacia sp.) and they were identified through of the cromatografía of paper; For this method it was found that the carotenoides's migration was bigger to the one belonging to chlorophylsdue to its bigger affinity for organic solvents, with results of Rfs: 0 ; 0,35; 0,59; and 0,77 for chlorophyl b, chlorophyl to, xanthophylls and carotenos, respectively. At a later time the pigments separated into ambient liquid, for which they utilized solvents of different polarity. It was observed when accomplishing espectrofotometría's technique than in carotenos the bigger absorbance presents of the 420 to 480 nm. In chlorophyls they encounter two ranges of maximum absorbance: Enter 400 -480nm and enter 580-660nm; and a great dead zone among 500 - 560 nm. Finally a band with the colors of the specter of visible light, excepting the violet and dark blue revealed the observation of the original extract diluted of spinach in the spectroscope. These observations correspond to the wavelengths of the 480 to the 680nm approximately. A red band, result of the fluorescence is observed after the 700nm.


INTRODUCCIÓN
La fotosíntesis es el proceso que permite a los vegetales obtener la materia y la energía que necesitan para desarrollar sus funciones vitales; se lleva a cabo gracias a la presencia en las hojas y en los tallos jóvenes de pigmentos, capaces de captar la energía lumínica. 2
Entre los distintos métodos que existen para separar y obtener esos pigmentos se encuentra el de la cromatografía, que es una técnica que permite la separación de las sustancias de una mezcla y que tienen una afinidad diferente por el disolvente en que se encuentran. De tal manera que al introducir una tira de papel en esa mezcla el disolvente arrastra con distinta velocidad a los pigmentos según lasolubilidad que tengan y los separa, permitiendo identificarlos perfectamente según su color.
 El principal de esos pigmentos es la clorofila, de color verde, de la que existen varios tipos (bacterioclorofilas y clorofilas a, b, c y d). Ademas de las clorofilas, otros pigmentos presentes en todos los organismos eucarióticos son los carotenoides (carotenos y xantofilas), de color amarillo o anaranjado y que tienen un papel auxiliar en la captación de la luz, ademas de un papel protector.
Los objetivos de la practica son extraer, separar e identificar los principales pigmentos presentes en las hojas verdes de espinaca, determinar el espectro de absorción de luz visible de dichos pigmentos y relacionar las propiedades de absorción de luz con las funciones que cumplen los pigmentos.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se llevaron a cabo tres procedimientos para el desarrollo de la practica

1. Cromatografía.

A cada grupo se le suministraron 15 ml del extracto de pigmentos que se obtuvo calentando hojas de espinaca en etanol del 96% hasta que quedaron blancas. A este extracto se le realizó los siguientes tratamientos:

a) Con un capilar se colocó la muestra en el punto de origen en la tira de papel de filtro, con gotas pequeñas y manteniendo el diametro de la mancha alrededor de 5 mm. Se realizaron varias aplicaciones hasta que quedó una mancha verde oscuro.

b) se introdujo luego la tira de papel con la muestra en un tubo largo, en el que previamente se había puesto la mezcla de solventes para la cromatografía (acetona: éter petróleo (10:90 por volumen)). Se tapó bien el tubo y se sostuvo en posiciónvertical con la ayuda de un soporte y una pinza-nuez.

c) se dejó desarrollar el cromatograma en la oscuridad (colocando una cubierta de tela oscura sobre el tubo) 45 min.

d) Al terminar, se sacó el cromatograma y se secó al aire en la oscuridad, durante algunos minutos.

e) finalmente, se observaron las posiciones relativas y los colores de cada componente. Se Delineó su perímetro con lapiz, para determinar los Rfs.

2. Separación de los pigmentos en medio líquido.

a) A 10 ml de éter de petróleo se le adicionó 5 ml del extracto de pigmentos y se agitó bien.

b) Se tomaron 5 ml de la parte superior de la suspensión resultante y se le añadió 2.5 ml de una solución de KOH al 10%. Se agitó bien y se dejó reposar hasta que se separaron las capas de pigmentos amarillos y verdes.

c) Se agregó agua destilada, de 1 en 1 ml agitando fuertemente cada vez, hasta agregar un total de 7 ml. Se agitó bien y se dejó reposar por 15 minutos; al cabo de este tiempo aparecieron dos capas: la superior, amarilla (que contenía los carotenos y xantofilas) y la inferior, verde (una fase acuosa con las clorofilas).

d) Se pasó la capa con los pigmentos amarillos a otro tubo de ensayo. Se midió este volumen y se añadió igual cantidad de éter de petróleo y de metanol. Se agitó bien y se dejó reposar por varios minutos. Al cabo de este tiempo la mezcla se separó dos capas: una superior (etérea, que contenía los carotenos) y una inferior (alcohólica, que contenía las xantofilas).

e) Con ayuda de un espectrofotómetro se halló el espectro de absorción de luz visible de los pigmentos separados,utilizando intervalos de 20 nm, desde 400 hasta 600 nm para los carotenos y de 400 a 700 nm para las clorofilas.

3. Observación a través del espectroscopio.

Se Observó parte del extracto original a través del espectroscopio prestando importancia a la presencia de fluorescencia al iluminar el extracto con los pigmentos. Se anotaron las longitudes de onda (colores) ausentes en el espectro para comparar esta observación con los espectros obtenidos en el punto anterior.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En los tres procedimientos que se llevaron a cabo, se obtuvieron los siguientes resultados

1. CROMATOGRAFÍA


El objetivo principal del calentamiento de las hojas de espinaca en etanol al 96% en la obtención del extracto de pigmentos, es porque la deshidratación rapida con temperaturas elevadas y solventes organicos, bloquea instantaneamente la actividad respiratoria de los tejidos vegetales, inactiva sistemas enzimaticos presentes y destruye la flora bacteriana. Ademas se obtiene gran contenido de pigmento que no sufre reducción severa.

La cromatografía se debe realizar en la oscuridad probablemente porque se trata de pigmentos fotosintéticos que al recibir fotones se cargan de energía y al no liberarla, se desestabilizan y se desintegran.

La cromatografía realizada del extracto de espinaca (figura 1) reveló los siguientes resultados


|PIGMENTOS DE EXTRACTO DE ESPINACA |
|Rf |Color |
|0.19 |Verde oliva |
|0.35 |Verde|
|0.59 |Amarillo |
|0.77 |Amarillo quemado |


Tabla 1. Rf calculados de los pigmentos revelados por la cromatografía del extracto de espinaca. Duración de la cromatografía 45 min.


[pic]
Figura 1. Resultado de la cromatografía.
Se observan las manchas de los distintos pigmentos encontrados en las hojas de espinaca. 1. Clorofila b; 2. Clorofila a; 3.Xantofilas; 4. Carotenos.

Dado que se trata de un extracto de espinaca, una planta superior, se espera que los pigmentos a encontrar son la clorofila a y b, ademas de pigmentos accesorios como los carotenos y las xantofilas.

En base a la estructura molecular de los pigmentos se puede determinar cual es el factor de retraso (Rf) que les corresponde. Se sabe que un Rf alto representa una molécula que tiende a ser hidrófoba y por lo tanto muy poco cargada, mientras que un Rf bajo nos muestra una molécula que presenta grupos cargados y por lo tanto hidrofila.

El calculo para hallar el Rf de los pigmentos es
Rf = distancia recorrida por el soluto
distancia recorrida por el . . solvente
Así, en cada caso se obtuvo

Rf (verde oliva)= 3.1/16.3=0.19
Rf (verde)= 5.7/16.3=0.35
Rf (amarillo) 9.6/16.3=0.59
Rf (amarillo quemado)= 12.6/16.3= 0.77

Atendiendo a estos resultados, se puede presumir que los Rf de 0.19 y 0.35 corresponden a los dos tipos de clorofila (a y b), apoyados también en que coinciden con los colores verde oliva y verde,respectivamente. La estructura general de la clorofila es una cadena cíclica de cuatro pirroles, que en su centro estan unidos a un atomo de magnesio (Mg) al que se enlazan cada uno con su nitrógeno (N). Un pirrol presenta un grupo aldehído y otro metilo, el siguiente pirrol un grupo éster seguido de una cadena de fitol, el siguiente pirrol un grupo cetónico seguido de un éster. Los grupos que aportan al caracter hidrofílico de la molécula son los nitrógenos.

La gran diferencia entre las dos clorofilas es la presencia en el cuarto pirrol de un grupo metil o un grupo aldehído; en la clorofila a se presenta el primero y en la clorofila b el segundo. Teniendo en cuenta que el grupo aldehído de la clorofila b proporciona a la molécula un cierto grado mas de caracter hidrófilo se puede concluir que el Rf 0.19 corresponde a la clorofila b y el Rf 0.35 corresponde a la clorofila a. 4

Los carotenos por el contrario son derivados tetraterpénicos que presentan dobles enlaces conjugados y un anillo ciclohexano insaturado en cada extremo de la cadena lineal. Son sustancias solubles en solventes organicos y se observan de color anaranjado.

Las xantofilas son derivados oxigenados de los carotenoides, por lo tanto pueden presentar un oxigeno con doble enlace a un carbono de uno o de los dos ciclohexanos.

Dada las estructuras de los carotenos y xantofilas es facil apreciar que los carotenoides (carotenos y xantofilas) presentes en las hojas de espinaca son mucho menos hidrófilos que las clorofilas; sin embargo las xantofilas son mas hidrófilas si se comparan con los carotenos, debido a la presencia degrupos éter en los ciclohexanos.

Se deduce que el Rf de 0.77 corresponde a los carotenos y el Rf de 0.59 corresponde a las xantofilas.

Las xantofilas y carotenos, juegan un papel decisivo en la disipación de la energía solar excedente, reduciéndose y oxidandose. El exceso de luz en las plantas ataca directamente a los centros de reacción del fotosistema II. La acumulación de energía de excitación que no puede ser eficientemente canalizada hacia la ruta fotoquímica provoca la rapida destrucción de una de las subunidades proteicas del PS II, la denominada proteína D1. En ese momento se interrumpe el transporte electrónico y disminuye la eficiencia del PS II. Es lo que se conoce como fotoinactivación del PS II. Esta proteína D1 es rapidamente sintetizada de nuevo y reemplazada en los fotosistemas. Pero cuando la tasa de destrucción de D1 supera la de síntesis y reparación se acumulan fotosistemas inactivos, incrementa la carga energética del sistema que no puede ser transferida y los diferentes componentes moleculares del entorno pueden resultar irreversiblemente dañados. SEPARACION DE LOS PIGMENTOS EN MEDIO LÍQUIDO

Al agregar éter de petróleo el extracto se separa en dos fases, una liquida en la superficie, de color verde esmeralda, y otra inferior como un sedimento mas oscuro. El éter de petróleo actúa como un separador de pigmentos por los cuales tiene afinidad.

Luego, al agregar KOH al 10% a la capa de la superficie se separan dos fases: la superior es liquida, poco densa y de color amarillo, que corresponde a los carotenos y xantofilas; la inferior es espesa y de un color verdeesmeralda, que corresponde a las clorofilas.

La hidrólisis de la clorofila con hidróxido de potasio tiene por objeto disminuir el caracter hidrófobo del pigmento. La solución de KOH debe estar levemente saturada para que realice completamente la saponificación de la clorofila. Así, ésta se convierte a la forma soluble en agua.

Los grupos fitil y metil de la clorofila son reemplazados por iones potasio, y el anillo carboxílico es abierto obteniéndose un fitol (un alcohol insaturado) y metanol 1 (ver figura 2


















Figura 2. Reacción de la clorofila con hidróxido de potasio. Los grupos fitil (rojo) y metil (azul) son reemplazados por iones potasio.



Al agregar los 7ml de agua destilada se da una separación definida de las dos capas, con la presencia de un fenómeno de efervescencia.

Después de separar la fase superior que contiene los carotenos, se le adiciona éter de petróleo y alcohol metílico para retirar los últimos restos de cera, donde ocurre de nuevo una separación, pues los carotenos son insolubles en el alcohol metílico y por lo tanto quedan en la capa superior etérea, y las xantofilas quedan en la capa inferior alcohólica.

Posteriormente al leer el espectro de absorción de luz visible para carotenos (400-680 nm) y clorofilas (400-700 nm). Se observó que en los carotenos la mayor absorbancia se presenta de los 420 a 480 nm (ver figura 3) de tal manera que absorben las longitudes de onda que corresponden a los colores del violeta al verde, reflejando así el amarillo. La principal función de los carotenos en las plantas es prevenir lafoto-oxidación de las clorofilas, ademas de servir como protectores y captadores de energía solar 1, ya que absorben longitudes de onda que no absorben las clorofilas. Los resultados son los siguientes


|CAROTENOS | |
|Longitud de onda (nm) |absorbancia |
|400 |0.699 |
|420 |1.210 |
|440 |1.588 |
|460 |1.516 |
|480 |1.422 |
|500 |0.350 |
|520 |0.032 |
|540 |0.010 |
|560 |0.006 |
|580 |0.003 |
|600 |0.005 |


Tabla 2. Absorbancia de los carotenos a longitudes de onda entre 400nm-600nm

En las clorofilas se presentan dos rangos de maxima absorbancia, entre 400 – 480 nm y entre 580 -660 nm; y una gran zona muerta entre 500- 560 nm (ver figura 3), donde la absorción de la luz es relativamente débil. Los espectros de absorción de la clorofila a y b son diferentes, la luz que no es absorbida por la clorofila a, por ejemplo a 460 nm, es capturada por la clorofila b que tiene un mayor poder de absorción a esa longitud de onda. 3 Por lo tanto, estos dos tipos de clorofila son complementarios en la absorción de energía solar. Lafunción de las clorofilas en las plantas es captar directamente la energía solar; son unos receptores muy efectivos, puesto que contienen una red alterna de enlaces dobles y sencillos, en otras palabras son polienos, y tienen un poder de absorción muy fuerte en la región del espectro visible donde la energía solar que llega a la tierra es también maxima 1. Los resultados obtenidos son los siguientes:

|CLOROFILAS | |
|Longitud de onda (nm) |absorbancia |
|400 |0.835 |
|420 |1.234 |
|440 |0.473 |
|460 |0.332 |
|480 |0.141 |
|500 |0.078 |
|520 |0.076 |
|540 |0.072 |
|560 |0.076 |
|580 |0.102 |
|600 |0.125 |
|620 |0.161 |
|640 |0.332 |
|660 |0.194 |
|680 |0.056 |
|700 |0.030 |


Tabla 3: absorbancia de las clorofilas a longitudes de onda entre 400nm-700nm

Para visualizar el comportamiento de los pigmentos conrespecto a las longitudes de onda absorbidas se construyó la siguiente figura:

[pic]

Figura 3. Comparación de los espectros de absorción de las clorofilas y carotenos. Se observa que la mayor absorbancia de los carotenos se da a 440 nm, y en las clorofilas se presentan dos puntos de maxima absorbancia, a 420 nm y 650nm.


3. OBSERVACIÓN A TRAVÉS DEL ESPECTROSCOPIO.

La observación del extracto original diluido de espinaca en el espectroscopio reveló una banda de espectro con los colores: verde, verde limón, amarillo, naranja y se alcanza a observar la presencia de un rojo bastante tenue. Estas observaciones corresponden a las longitudes de onda de los 480nm a los 680nm aproximadamente. Estos resultados coinciden con los obtenidos en la medición de la absorbancia de los distintos pigmentos. Así, dado que las clorofilas a y b absorben intensamente la luz del azul oscuro (400-480nm) y del rojo (580-660nm), la luz que no se absorbe sino que se refleja por los cloroplastos es verde, presentandose una zona muerta entre los 500-560nm, que es precisamente una de las zonas del espectro de luz vistas al espectroscopio .

Finalmente, como las clorofilas y los carotenos son pigmentos complementarios; es decir, mientras las clorofilas absorben ciertas longitudes de onda, los carotenos absorben aquellas no absorbidas por las primeras, se debió observar casi todo el espectro de luz visible, exceptuando el violeta y el azul oscuro que es absorbido tanto por los carotenos como por las clorofilas (400-480nm), por lo tanto no se refleja este color.

Se debió observar al espectroscopio: un azulverdoso (absorbido por los carotenos pero no por las clorofilas- 480 nm) verde, amarillo y naranja (que no son absorbidos ni por los carotenos ni por las clorofilas-500-580nm) y algunos tonos de rojo (absorbidos por las clorofilas pero no por los carotenos-
> 600nm).

Después de los 700nm se observa una banda roja, resultado de la fluorescencia. La absorción de un fotón por una molécula supone la transición desde su estado de mínima energía a uno de sus estados de mayor contenido energético (excitación). Esto supone un cambio en su estado electrónico. El excitón lleva a un estado altamente inestable a la molécula que lo ha absorbido, por lo que tendra una gran tendencia a soltar esa energía (relajación o desexcitación). La vuelta al estado inicial, con emisión de un fotón idéntico, es muy improbable, ya que parte de la energía de excitación se perdera en forma de calor. Algunas moléculas (como las clorofilas) pueden emitir fotones de radiación menor a la recibida en forma de fluorescencia.


BIBLIOGRAFIA

1 Ramos Rodríguez, Aulio Alberto. Extracción de clorofila y β-caroteno a partir de las hojas de matarratón, espinaca y alfalfa. Tesis de grado 1984. Pag. 16, 25, 26 y 13.

2 Bentley, Kenneth Walter. The Natural Pigments. 1960. Estados Unidos. Pag. 312-315

3 Stryer, Lubert. Bioquímica. Cuarta edición. Tomo II. Editorial Reverte, S.A, Barcelona, 1995. Pag. 14

4. MATHEUS, C. K. Bioquimica 3ª edicion 2002. Pearson educación. Pag. 672-673

5 Raven, P.H., Evert, R.F. y Eichhorn, S.E. (1999). Biology of plants. New York: Worth Publishers. 6ta edición. Pag. 126-149, 495-514.