CASOS PRACTICOS
CASO 1
A nuestro laboratorio llega una muestra de agua procedente de un rio en el que se sospecha se produjo un vertido de sustancias químicas, algunas de ellas toxicas para animales. Nos piden que determinemos si la sustancia M438 esta presente en el agua y en que concentración.
* Etapa 1ª: analisis cualitativo: determinación de las longitudes de onda de excitación y emisión.

La investigación de las propiedades de fluorescencia de un compuesto requiere, en primer lugar la obtención de los espectros de extracción y de emisión, a fin de
a) Seleccionar las condiciones de operación para aplicaciones posteriores cuantitativas en el espectrofluorimetro
b) Conocer los maximos de excitación y de emisión, lo cual nos permitira saber si la sustancia esta presente en la muestra al comparar esos valores con un patrón

conocido.

ESPECTRO DE EXCITACIÓN |
λ(nm) | Fluorimetría (UAF) |
300 | 21 |
310 | 30 |
320 | 48 |
330 | 67 |
340 | 75 |
350 | 38 |
360 | 18 |
ESPECTRO DE EMISIÓN |
λ(nm) | Fluorimetría (UAF) |
480 | 16 |
460 | 29 |
440 | 53 |
420 | 98 |
400 | 82 |
380 | 57 |
360 | 11 |

ESPECTRO DE EMISIÓN |
λ(nm) | Fluorimetría (UAF) |
480 | 16 |
460 | 29 |
440 | 53 |
420 | 98 |
400 |82 |
380 | 57 |
360 | 11 |









Existe un pico de absorción a 340 nm y un pico de emisión a 420 nm; por lo que para saber si la sustancia M438 esta presente en esta agua tendremos que observar si sus maximos de absorción y emisión coinciden con los anteriores y, si es así, concluiremos con que la muestra de agua presenta esta sustancia.
Apuntar que se cumple el desplazamiento de Stokes, definido por la separación o diferencia entre el espectro de excitación, con mayor energía y por tanto menor longitud de onda, y el espectro de emisión, con menor energía y mayor longitud de onda.

* Etapa 2ª: analisis cuantitativo
Una vez comprobada la presencia de M438 y conocidas las longitudes de onda de excitación y emisión optimas en la parte 1, se procede a la cuantificación.
Realizamos una recta patrón con concentración conocidas de M438 y medimos en el espectrofluorímetro la fluorescencia seleccionando λ de absorción a 340nm y a 420nm. Posteriormente se mide la muestra (tanto los puntos de la recta patrón como la muestra se realizan por duplicado).

Para hacer la recta patrón podemos realizar previamente la media de los dos valores de fluorescencia obtenidos paracada concentración, pero para obtener una recta mas precisa usaremos todos los valores, a los cuales se les resta previamente el valor medio del blanco (0,875), ya que así disminuye el nivel de error.
Tubos | Lecturas del espectrofluorimetro(UAF) |
blanco 0 | 1 | 0,75 |
patrón 1- 0,4mM | 16,7 | 16,5 |
patrón 2- 0,8mM | 38,8 | 41,1 |
patrón 3- 1,6mM | 73,6 | 78,2 |
patrón 4- 3,2mM | 148,5 | 139,4 |
Muestra ¿? | 60,8 | 61,6 |

Una vez que restamos el valor medio del blanco(0,875), los resultados son:

Tubos | Lecturas del espectrofluorimetro(UAF) |
patrón 1- 0,4mM | 15,825 | 15,625 |
patrón 2- 0,8mM | 37,925 | 40,225 |
patrón 3- 1,6mM | 72,725 | 77,325 |
patrón 4- 3,2mM | 147,625 | 138,525 |


| |


Media = 61,2
Media = 61,2
60,8
60,8
A partir de la ecuación de la recta, determinaremos la concentración en la que se encuentra la sustancia M438 sustituyendo los valores de fluorescencia de los picos de excitación y emisión en dicha ecuación. Posteriormente, se hace la media de ambos valores.
61
61,6
Muestra

Ecuación de la recta: y = 44,8x + 1,025
61,2 = 44,8x + 1,025 x = 1,343mM de M348 hay en la muestra de agua.


CASO 2:
Utilización de la técnica de espectrofluorimetría para el analisis deltriptófano cerebral.
El triptófano (Trp) es un aminoacido esencial que se engloba con otros (tirosina, valina, fenilalanina, leucina e isoleucina) dentro del grupo de aminoacidos neutros. El Trp circulante es transportado al cerebro a través de la barrera hematoencefalica mediante un sistema de transporte esteroespecífico y saturable. Este Trp cerebral sera utilizado como precursor en la síntesis de serotonina, un neurotransmisor que interviene en numerosas funciones cerebrales. Teniendo en cuenta que la concentración cerebral de Trp puede regular la síntesis de serotonina, tratamos de averiguar en este experimento si el Trp y los otros aminoacidos neutros utilizan el mismo transportador del cerebro.

Animales de experimentación: trucha arco iris. Cuatro grupos experimentales con 8 truchas cada uno.
-Grupo 1: control-no inyectados
-Grupo 2: inyectados con solución de preparación de los aa
-Grupo 3: inyectados con Trp
-Grupo 4: inyectados con Trp + otros aa neutros.

Muestras: cerebros
Etapas:
-Administración de los tratamientos intraperitonealmente
-Toma de muestras: extracción de los cerebros
-Homogenización de los cerebros
-Realización de una recta patrón a partir de una solución stock de Trp (5concentraciones)
-Se mide la fluorescencia de las distintasconcentraciones de la recta patrón y de las muestras (32 cerebros homogenizados

Condiciones de medida en el espectrofluorímetro: λ excitación 373nm, emisión 452nm.

RESULTADOS OBTENIDOS
Ecuación de la recta patrón y= 33,03x + 0,137 r2= 0,996
A partir de esta ecuación obtendremos los valores de concentración triptófano, al despejar la x, sustituyendo la y por los valores de UAF.
Grupo 1: 4= 33,03x + 0,137 x = 0,117µg/g
Grupo 2: 8= 33,03x + 0,137 x = 0,238µg/g
Grupo 3: 80= 33,03x + 0,137 x = 2,418 µg/g
Grupo 4: 55= 33,03x + 0,137 x = 1,661µg/g

| UAF(medida de los 8 cerebros) | Concentración de Trp(µg/g) |
GRUPO 1 | 4 | 0,116954284 |
GRUPO 2 | 8 | 0,238056312 |
GRUPO 3 | 80 | 2,417892825 |
GRUPO 4 | 55 | 1,661005147 |

CONCLUSIÓN:
A partir de los resultados obtenidos concluimos que el triptófano y los otros aa neutros utilizan el mismo transportador. Esto se deduce teniendo en cuenta que, el grupo 3 solo ha inyectado Trp y el grupo 4, ha inyectado Trp + otros aa neutros, obteniéndose menos concentracion de Trp en el cerebro en este último caso, ya que ademas de este aa contiene otros aa neutros que al usar el mismo transportador impiden que entre la misma cantidad de Trp que si solo entrara este, como ocurre en el grupo 3.