Establecimiento de YEMAS DE Polylepis incana Y Valeriana (Valeriana officinalis).


RESUMEN
Durante la siguiente experimentación se estudia el establecimiento y desarrollo de explantes de yemas axilares de Polylepis incana Y Valeriana (Valeriana officinalis) y su respuesta en diferentes medios de cultivo tanto para Polylepis y para valeriana. Luego de un periodo de incubación de días obscuridad , los explantes no lograron crecer favorablemente en el medio de cultivo, debido a que hubo presencia de contaminación fúngica y bacteriana.

Palabras Claves: Yema, Plylepis ,Valeriana officinalis.

INTRODUCCION
Una de las estrategias que permite la multiplicación masiva de plantas es la multiplicación in vitro por medio de yemas; la cual, ademas de producir plantas genéticamente uniformes e idénticas a la planta madre, otorgan la ventaja de producir plantas libres de patógenos (Salazar et al, 2009). Teóricamente, todos los brotes axilares o laterales pueden producir ramas axilares adicionales perpetuamente, por medio del subcultivo de cada uno de sus brotes en medios de cultivo adecuados. Por consiguiente, el cultivo de yemas es un método conveniente y rapido de multiplicación clonal; siendo aplicado a varias especies de plantas, desde herbaceas hasta leñosas (Roca M. W. et al, 1993).

Se ha logrado determinar queel cultivo de yemas in vitro es el mas adecuado en algunas especies de plantas. Así, Salazar (2009) hace referencia a que los segmentos mas adecuados de explantes son las hojas y yemas en la inducción de respuestas morfogenéticas in vitro de Agave sisalana. El-Morsy and B. Millet (1996) indican que la micropropagación en cítricos es factible a partir de yemas y meristemos, y partes del epicotíleo, raíz u hoja. Ademas, una de las ventajas del cultivo de yemas in vitro es que se pueden combinar con otras técnicas para mejorar su eficiencia; por ejemplo, el almacenamiento en frío de las yemas previo a ser introducidas en el medio de cultivo, ha dado excelentes resultados en conseguir morfogénesis directa en yemas de pinos maduros (U. Andersone y G. Ievinsh, 2002).
Pueden presentarse efectos de estrés debido a estímulos hormonales y otros estímulos en el medio nutritivo que pueden causar una acelerada maduración del explante (U. Andersone y G. Ievinsh, 2002). Por lo tanto, un factor importante es el uso de Citoquininas, la cual es una molécula hormonal que puede jugar un rol importante en la citocinesis, crecimiento y desarrollo de las plantas (R. Aloni et al, 2006). Se ha demostrado experimentalmente que las interacciones entre las Citoquininas y Auxinas son responsables de la formación rapida de yemas florales y el número de yemas producidas (A. Peeters et al, 1991).


Finalmente, durante la siguiente experimentación se estudia el establecimiento y desarrollo de explantes de yemas axilares y apicales de Polylepis incana YValeriana officinalis y su respuesta en un medio de cultivo Murashige-Skoog (MS) enriquecido con: 2mg.L-1 de N-Bencil-9-(2-tetrahidropiranilamino) purina (BAP) y 0.5mg.L-1 de Indol-3-Acetic Acid Free Acid (AIA), 30g.L-1 de azúcar. De esta manera, se espera analizar la supervivencia de los explantes y su crecimiento; para así compararlos con otras investigaciones en distintas especies vegetales, donde se ha logrado tener éxito en el establecimiento de yemas.
Polylepys incana es un Arbol de mediano porte, de unos 4-6 hasta 10 m. de altura, con follaje denso y el fuste de 40 o mas cm de diametro, irregular nudoso y revirado como en helicoide. La corteza externa es rojiza; posee ritidoma en laminas membranosas, exfoliables (Arica, 2006).

Esta distribuido desde el Ande Sur Hasta Bolivia. Esta especie prospera bien en lugares por encima de los 2800 msnm hasta los 5000 msnm o mas Crece en suelos pobres, de textura y naturaleza variable. Tolera la pedregosidad elevada.
Requiere de poca agua para su desarrollo (Arica, 2006).

Los usos son diversos, se puede obtener beneficios de la madera debido que tiene gran resistencia y dureza, ademas la corteza interna de esta especie es utilizada como medicina natural debido a sus propiedades; paliativo de las amigdalitis, inflamaciones en la garganta y resfríos (Arica, 2006).

La familia Valerianaceae comprende alrededor de 13 géneros y unas 300 especies, encontrandose en casi todo el mundo. En Chile se encuentran cuatro géneros: Plectritis y Stangea con una especie, Valerianella con tresespecies alóctonas) y Valeriana, que hasta la fecha registraba 44 especies (Saldivia & Rojas, 2006)

El género Valeriana comprende plantas hemicriptófitas, terófitas o sufrútices (caméfitos), con flores hermafroditas o unisexuales por aborto; caliz entero, dentado o desarrollado en vilano; corola 5-mera, gibosa en la base; androceo reducido a 3 estambres fértiles, los dos restantes estériles o abortados; ovario ínfero; fruto aquenio. Se distribuyen especialmente en la Cordillera de los Andes (Saldivia & Rojas, 2006).

MATERIALES Y METODOS

Preparación de Medio de Cultivo

Desinfección Material Biológico

Se procedió a desinfectar las yemas de Polylepis y Valeriana, de la siguiente manera: Para Polylepis en un principio se lavó con agua corriente la superficie de las yemas, retirando la mayoría de tierra e impurezas visibles. Luego se sumergieron completamente las yemas en una solución al 6% de detergente común mas tres gotas de Tween 20 durante 10 minutos y en constante agitación. A continuación, se enjuagó dos veces las muestras con agua destilada, con el fin de retirar el detergente del anterior lavado, y un tercer lavado con agua esterilizada. Sin realizar ningún enjuague, se sumergieron las yemas en una solución de cloro al 1 % mas 3 gotas de Tween 20, y se las mantuvo sumergidas en constante agitación durante 10 minutos. Posteriormente se sumergió en alcohol al 70% durante 1 minuto. Dentro de la camara de siembra y en condiciones asépticas, se procedió a realizar tres lavados de las yemas con agua esterilizada, hastaretirar el cloro del anterior lavado. Por último, dentro de la camara de siembra, se mantuvieron sumergidas las yemas en agua estéril hasta realizar la siembra.
Para valeriana se realizaron los mismos pasos que con Polylepis pero el detergente sebe estar al 3 % durante 10 minutos. Luego se hacen dos lavados y un tercer lavdo con thiramplus al 0 % por 10 minutos. Posteriormente se hacen dos lavados mas y se sumergió en cloro al 1 % mas 3 gotas de twin 20 por 20 minutos. Luego se colocó en alcohol al 70 % por 1 minuto. Dentro de la camara se hacen los mismos pasos que para Polylepis.
Siembra de Tejido

Luego del tratamiento de desinfección, se retiraron con la ayuda de las pinzas las yemas del agua del último lavado y se las ubicó sobre la superficie, se procedió retirar el tejido necrosado, para esto se realizó cortes pequeños de alrededor de 1 mm para retirar la primera capa de tejido de las yemas. Realizados los cortes, se procede a sembrar las yemas en el medio de cultivo.

Incubación de Explantes

A continuación de la siembra de los explantes de Polylepis y valeriana se incubo en obscuridad.

Evaluación de la Respuesta de los Explantes

Después de una semana de incubación se evalúo la contaminación en el medio de cultivo. Se esperó observar algún cambio o indicador de crecimiento del explante, como encorvamiento o crecimiento de la yema sembrada. Se registró cada observación de lo sucedido dentro del medio de cultivo.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
En el frasco con el explante de polylepis y el frasco con el explante devaleriana pudo observarse contaminación. En este caso la contaminación que se observó fue bacteriana, como puede observarse en las figuras 1 y 2.
En el cultivo de Polylepis tomentella Weddell ssp. entre los microorganismos contaminantes se pudo diferenciar diversos tipos de agentes fúngicos y bacterianos, siendo estos últimos los que se presentaron en mayor proporción en ambos ensayos (Vega Krstulovic & et.al, 2007).
Por lo que puede afirmarse que Polylepis spp. es susceptible a contaminación tanto fúngica como bacteriana pese a que en el trabajo mencionado anteriormente se cultivaron yemas apicales al igual que la practica realizada en el laboratorio de cultivo de tejidos de la Escuela Politécnica del Ejército.
Puede decirse también que existió una contaminación durante la manipulación del explante al momento del cultivo del mismo, ya que se cultivaron yemas apicales que debido a que es tejido meristematico se encuentra libre de enfermedades mas no de contaminación posterior por manipulación del mismo.
En el caso del explante de Polylepis pudo observarse oxidación del explante (Figura 3) que se cree de debió al método de desinfección usado que debió haber resultado agresivo para el explante.
La oxidación del explante no pudo haberse originado por los componentes del mismo debido a que las concentraciones usadas se tomaron de un trabajo de tesis en el que se cultivó polylepis. La contaminación no pudo haberse originado por el medio de cultivo contaminado debido a que al preparar el medio con anticipación se asegura laidenificación de medios contaminados para su posterior eliminación; para el caso los medios no presentaron contaminación previo al cultivo del explante.
Por otro lado el explante de valeriana luego de dos semanas presentó contaminación fúngica y bacteriana, como puede observarse en la figura 4. En el caso de la valeriana se cultivaron yemas laterales que a diferencia de las apicales estas no aseguran una planta libre de enfermedades, lo que pudo haber contribuido también a la presencia de contaminación.
La contaminación observada en valeriana es mucho mayor en comparación con la que presentó polylepis.
La valeriana también presentó oxidación del explante; en la figura 4 puede observarse en la parte superior del tallo una coloración marron En general la oxidación tanto de polylepis como de valeriana puede deberse a que las muestras se tomaron casi una semana antes de ser cultivados y estas se encontraban un poco maltratadas y secas al momento del cultivo lo que pudo haber contribuido a este hecho.
La contaminación en ambos casos pudo haberse debido a eerores en la manipulación de los explantes. La mala manipulación de los explantes, ya que según Castillo, 2004 es muy importante que se evite realizar movimientos bruscos dentro de la camara porque esto puede interrupir el flujo de aire.
El pasar las manos sobre el explante ya que por el transporte de partículas dichas corrientes de aire pueden contribuir a la contaminación del explante. Los errores pudieron deberse de manera general a fallas en la manipulación por la falta deexperiencia.

También existe la posibilidad de que se haya realizado una ineficiente desinfección de la sala de siembra (limpieza de los pisos y camaras), ya que se realizó la practica en el segundo grupo, el primer grupo pudo haber contribuido a la contaminación de las camaras.
CONCLUSIONES.

* Al usar yemas apicales se espera obtener plantas libres de enfermedades, pero depende de la manipulación del explante para obtener plantas libres de contaminación.

* Polylepis es susceptible a contaminación tanto fúngica como bacteriana, la segunda ocurre con mayor frecuencia.

* El método de desinfección debe ser suficiente para eliminar contaminación pero no demasiado para dañar el explante.

Referencias
* Arica, D. (2006). Documentos de google. Recuperado el 12 de Diciembre de 2010, de Polilepis Incana: https://docs.google.com/viewer?a=v&q=cache:Zfhd5q2uEJcJ:www.condesan.org/memoria/foresteria/DArica3.pdf+polylepis+incana&hl=es&gl=ec&pid=bl&srcid=ADGEESjfIfqCtkdjZubEqjeS3B8nYj7Tu2qoH2C60b8Q9lKFAHy7ULCg4X1F

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* Anton J. M. Peeters, Will Gerards, Gerard W. M. Barendse, and George J. Wullems. In Vitro Flower Bud Formation in Tobacco: Interaction of Hormones. Plant Physiol 97, 402-408, 1991.

* El-Morsy and B. Millet. Rhythmic Growth and Optimization of Micropropagation: The Effect of Excision Time and Position of Axillary Buds on in vitro Culture of Citrus aurantium

* Efraín Salazar, Pablo Gonzalez y Carlos Hernandez. Multiplicación in vitro De Agave cocuiTrelease a través de Yemas Axilares. Agronomía Trop. 59(2): 129-135. 2009.

* L. Annals of Botany 78: 197-202, 1996.
* R. Aloni, E. Aloni, M. Langhans, and c. I. Ullrich. Role of Cytokinin and Auxin in Shaping Root Architecture: Regulating Vascular Differentiation, Lateral Root Initiation, Root Apical Dominance and Root Gravitropism. Annals of Botany 97: 883–893, 2006.

* Saldivia, P., & Rojas, G. (2006). Documentos google. Recuperado el 12 de Diciembre de 2010, de Valeriana: https://docs.google.com/viewer?a=v&q=cache:ovh7LrE5fyEJ:www.scielo.cl/pdf/gbot/v63n2/art06.pdf+valeriana+filetype:pdf&hl=es&gl=ec&pid=bl&srcid=ADGEESixB2ybKmEOJ3MVMH3QhvoPrvbiVQ3Hqf5Du0P7NrFDn7vfufV6T13-PSg5hQY-x8fGBVcWFhnv-7ep_-Bpn-kKEeJ1jc0OdxDBjTBBpjYzI

* Una Andersone and Gederts Ievinsh. Changes of Morphogenic Competence In Mature Pinus Sylvestris L. Buds in vitro. Annals of Botany 90: 293-298, 2002.
* Vega Krstulovic, C., & et.al. (2007). Propagación masiva de Polylepis tomentella Weddell ssp. nana mediante técnicas de cultivo in vitro. Bolivia.
* William M. Roca, Luis A. Mroginski. Cultivo de Tejidos en la Agricultura, Fundamentos y Aplicaciones. Centro Internacional de Agricultura Tropical, Colombia. 1993

Anexos.
Figura 1. Cultivo in vitro de yemas laterales de valeriana.

Figura 2. Cultivo in vitro de yemas laterales de Polylepis incana.

Figura 3. Presencia de oxidación del explante de Polylepis cultivado in vitro.

Figura 4. Crecimiento fungico y contaminación bacteriana en el frasco con explantes de valeriana.