EXTRACCION DE ADN NUCLEAR A PARTIR DE TEJIDO DE PIE Y MANTO DE Cittarium pica POR PRECIPITACION CON CLORURO DE SODIO Y DETERMINACION DE CALIDAD MEDIANTE ANALISIS ELECTROFORETICO DE TIPO HORIZONTAL

NUCLEAR DNA EXTRACTION FROM FOOT AND MANTLE TISSUE OF Cittarium pica
BY PRECIPITATION WITH SODIUM CHLORIDE AND QUALITY DETERMINATION BY
ELECTROPHORETIC ANALYSIS HORIZONTAL

RESUMEN
El objetivo de este analisis de laboratorio fue realizar una extracción de ADN de tejidos del
manto y del pie de la especie Cittarium pica y verificar la calidad del mismo mediante
electroforesis horizontal en gel de agarosa 0.8%, mediante el método de sal común
(cloruro de sodio). El procedimiento consistió en tomar 2 muestras 1,5 mg de tejido del pie
y del manto respectivamente y se rotularon (P1, P2, M1, M2) aplicar el protocolo de sal
común para extracción, suministrado por el docente. La calidad del ADN se verificó

mediante gel de agarosa al 0.8%, en camara de electroforesis horizontal a 80V durante 30
minutos sumergida en tampón TAE 1X, con tinción de bromuro de etidio. El resultado
muestra que solo la muestra de manto M1 fue la única con suficiente material genético
como para correr en el gel. Se concluye que debió haber mayor tiempo deincubación
posterior a la añadidura de NaCl [5M].

PALABRAS CLAVE: Método de sal común, Electroforesis horizontal, Gel de agarosa
0.8%, Extracción de ADN, Cittarium pica.

ABSTRACT
The objective of this lab was to conduct a DNA extraction from the mantle tissue of the foot
and the species Cittarium pica and verify its quality by horizontal electrophoresis on 0.8%
agarose gel, by the method of common salt (chloride sodium). The procedure was to take
two 1.5 mg samples of tissue of the foot and mantle respectively and labeled (P1, P2, M1,
M2) to implement the protocol for extracting salt, provided by the teacher. DNA quality was
verified by agarose gel 0.8%, in horizontal electrophoresis chamber 80V immersed for 30
minutes in 1X TAE buffer with ethidium bromide staining. The result shows that only the


O. Aguilar, D. Polo-Jiménez, E. Ropain.

mantle sample M1 was the only one with enough genetic material to run on the gel. We
conclude that it must have greater incubation time after the addition of NaCl [5M].

KEY WORDS: Salt method, Electrophoresis horizontal 0.8% agarose gel, DNA extraction,
Cittarium pica.
INTRODUCCIÓN
El analisis de la molécula de ADN
constituye una herramienta muy valiosa
que ha permitido delinear estrategias
aplicadas a la investigación basica y al
diagnostico de innumerables entidades
de origen genético, basando esto en el
principio de que la molécula es única en
cada individuo (excepto en gemelos
monocigoticos) y contiene toda la
información necesariapara el desarrollo
y función de los organismos. (Falcon et
al, 2007).
El ADN puede ser extraído de muchos
tipos de materiales biológicos y el éxito
del analisis molecular depende de su
adecuado aislamiento en términos de
cantidad, calidad y pureza; es necesario
separarlo del resto de componentes
celulares así como del material no
biológico que pueda estar presente.
(Cummings, 1994). Los protocolos de
extracción buscan eliminar o diluir
potentes inhibidores de reacciones de
amplificación que eviten o dificulten
analisis posteriores. (Liu et al, 2004)
El proceso general de aislamiento
involucra tres pasos: primero, la lisis de
las membranas celulares, mediante el
uso de buffer específicos y altas
temperaturas; segundo, la degradación
de las proteínas por incubación con
proteinasa K y/o sales saturadas; tercero,
la extracción del ADN y su precipitación

mediante
el
uso
(Cummings, 1994)

de

alcoholes.

Despues de la extracción de ADN lo
común es verificar su calidad y cantidad.
El proceso mas sencillo de realizar se
denomina electroforesis. (Rotureau et al,
2006). La electroforesis de acidos
nucleicos es el método habitual para
separar, identificar y purificar moléculas o
fragmentos de DNA y RNA. En los
tampones habitualmente utilizados, los
acidos
nucleicos
estan
cargados
negativamente y migran hacia el anodo.
Cada molécula aporta una carga
negativa (procedente del grupo fosfato),
por lo que la relación carga/tamaño es
practicamente constante e idéntica paratodas las moléculas, independientemente
de su tamaño (un nucleótido tendra la
misma movilidad que un fragmento de
doble cadena de 800pb o uno de 5kb).
(Aljanabi, 1997). Se lleva a cabo en geles
de agarosa o poliacrilamida. Ambos
soportes son restrictivos para los acidos
nucleicos, de modo que los diferentes
fragmentos (al tener la misma relación
carga/tamaño), migran en función de su
tamaño y/o conformación química.
Los geles de agarosa (en cubetas
horizontales) se utilizan generalmente
para separar fragmentos grandes de
DNA (500pb-10Mb); Utilizando agarosas
de distintas concentraciones (distinto
grado de reticulación) pueden separarse
fragmentos de hasta 50kb aplicando un


O. Aguilar, D. Polo-Jiménez, E. Ropain.

campo eléctrico constante. La pureza
de la agarosa y de la solución
tampón (TAE o TBE) puede variar
según
la finalidad
del
ensayo.
(Westermeier, 1997). Es
posible
reutilizar una solución de agarosa
para fines de una simple visualización
de algún producto de PCR. No se debe
reutilizar cuando se va a cuantificar ADN
ni a extraer bandas a partir del gel. Para
reutilizar la solución de agarosa se
recomienda guardar el gel en un envase
con tapa, esto evita la evaporación y la

entrada de polvo. En caso dado de que
se evapore algo de la solución se puede
completar el volumen con solución
tampón limpia.(Duina-Posso, 2008)

MATERIALES Y MÉTODOS

un nuevo tubo previamente esterilizado y
se le adicionaron 600µl de alcohol etílico
absoluto frio paraprecipitación.
Por
inversión se agito alrededor de 30-40
veces y se incubo durante alrededor de
15 minutos a una temperatura de -20°C
para luego centrifugarlo a 14.000 rpm
durante 10 minutos con el fin de
precipitar el ADN.

Extracción
El procedimiento consistió en tomar y
rotular 2 muestras 1,5 mg de tejido del
pie y del manto respectivamente de un
individuo
de
la
especie
antes
mencionada y fragmentarlos con ayuda
de un bisturí en un tubo eppendorf de
1.5µl previamente esterilizado. Con el fin
de desnaturalizar componente biológico
diferente al ADN se adicionaron 300µl de
solución lisis y 1µl de proteínasa K y se
sometió a incubación a 65°C durante 1
hora. Con la ayuda de un vortex se agito,
se agregaron 300µl de NaCl [5M] y
nuevamente se agito con el vortex
durante 10 segundos.
Posterior a este proceso se sometió a las
muestras a centrifugación durante 15
minutos con el propósito de separar el
ADN de las proteínas y otros residuos.
Esto ocasiona que se formen dos capas
dentro del tubo, una de las cuales, el
sobrenadante, contiene el material
genético. Se transfirió el sobrenadante a

El objetivo de este ejercicio de
laboratorio fue realizar una extracción de
ADN de tejidos del manto y del pie de la
especie Cittarium pica mediante el
método de sal común (cloruro de sodio) y
verificar la calidad del mismo mediante
electroforesis horizontal en gel de
agarosa 0.8%.

Verificación por electroforesis
horizontal
La calidad del ADN se verificó mediante
geles de agarosa al 0.8%,en camara de
electroforesis horizontal a 80V durante
30 minutos sumergida en tampón TAE
1X, con tinción de bromuro de etidio. El
marcador de corrida usado fue azul de
bromofenol. Para la lectura se utilizo un
transiluminador UVP BioDoc en donde
una banda nítida indicaría que la
extracción fue positiva.


O. Aguilar, D. Polo-Jiménez, E. Ropain.

Tabla 1. Materiales de laboratorio y reactivos utilizados durante los procedimientos de
extracción y verificación.
Extracción de ADN
Micropipetas
Material fungible (Puntas, gradillas de plastico,
tubos de 1.5 ml.)
Pinzas y bisturí
Mechero
Vortex
Microcentrifuga
Baño de María
Refrigerador
Solución lisis
Proteinasa K
Homogenizadores
RNAsa
Cloruro de sodio (NaCl) [5M]
Alcohol etílico absoluto y al 75%
Buffer TE
Agua bidestilada y autoclavada
Papel absorbente

RESULTADOS
Como se observa en la Figura 1, de las
cuatro
muestras
sometidas
a

Electroforesis horizontal
Calculadora
Camara de electroforesis horizontal y
accesorios
Micropipetas de 1-10 uL
Puntas descartables de 1-10 uL
Lamina de papel parafina
Solución de Agarosa 0,8%
Buffer TAE 1X para la corrida
Fuente de Poder
Material Biológico
Tejido extraído de espécimen cultivado en
el Laboratorio de Moluscos y Microalgas
de la Universidad del Magdalena.

electroforesis horizontal solo “corrió” la
N° 1 del manto (M1).

Figura 1. Registro fotografico de una corrida electroforética de muestras de pie y manto de
Cittarium pica para verificación de calidad de ADN.Carriles M1 y M2: Muestras de manto; P1 y P2:
muestras del pie.


O. Aguilar, D. Polo-Jiménez, E. Ropain.

DISCUSIÓN

Este ejercicio de laboratorio demostró la
efectividad de la extracción de ADN
mediante el protocolo de sal común,
desarrollado. Este es un método simple,
reproducible,
económico
y
no
contaminante, facil de utilizar para la
obtención de material genético a partir de
tejidos de Cittarium pica.
Es de anotar, que los resultados
obtenidos con el método de extracción
por sal común se compararon con los
resultados para los mismos tejidos de la
misma especie pero mediante la
metodología de kits comerciales y se
observo que a partir del manto se
obtienen mejor calidad de ADN y mejores
corridas en el proceso de verificación por
electroforesis horizontal. (Ver Figura 1).
Sin embargo, se observa también que la
muestra P2 del método de kits
comerciales alcanzo a correr en el carril
del gel de agarosa especificado para
esta. Esto indica que haya hecho falta
someter a un proceso de destrucción
mecanica del tejido por mayor tiempo y

AGRADECIMIENTOS
Agradecimientos al personal de apoyo
del Laboratorio de Genética Molecular de
la Universidad del Magdalena por el

con mayor fuerza por unidad de area.
Sambrook et al (1989) econtraron que un
mayor esfuerzo de fragmentación
mecanica de tejidos duros ofrece una
mejor liberación de células al medio y por
lo tanto mejores rendimientos.
De acuerdo con los resultados de este
ejercicio de laboratorio., se concluyo lanecesidad de someter a un mayor tiempo
de incubación a las muestras, posterior a
la adición de NaCl 5M y alcohol etílico,
respectivamente. En este sentido,
autores como Miesfeld (1999) y CIMMYT
(2006) proponen tiempos de incubación
de 1 hora para obtener mayor ADN en la
precipitación.
Teniendo en cuenta los anteriores
resultados se recomienda aplicar e
identificar nuevas estrategias para lograr
una extracción eficiente y de mejor
calidad a partir de este tipo de muestras;
Tales como mayor esfuerzo de
fragmentación mecanica a tejidos duros y
mayor tiempo de incubación a las
muestras posterior a la adición de NaCl
5M y alcohol etílico. De igual forma, se
elucida que posiblemente sea mas
eficiente ir directamente al manto para
realizar procesos de extracción en ves
del pie.

apoyo logístico, el suministro de insumos
y por la cesión de un espacio para la
realización del presente ejercicio de
laboratorio.


O. Aguilar, D. Polo-Jiménez, E. Ropain.

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