=PRUEBAS BIOQUIMICAS=
Las pruebas bioquímicas consisten en distintos test químicos aplicados a medios biológicos, los cuales, conocida su reacción, nos permiten identificar distintos microorganismos presentes.
Su sistema de funcionamiento generalmente consiste en determinar la actividad de una vía metabólica a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer incorpora o no.
Para realizar las pruebas bioquímicas se dispone de múltiples medios, los cuales se deben aplicar de acuerdo a las exigencias del microorganismo en estudio.
Las pruebas bioquímicas no determinan cultivos mixtos son única y exclusivamente para microorganismos puros.
Fundamentos de las Pruebas Bioquímicas Comúnmente Utilizadas en un Laboratorio de Microbiología.

* Prueba 'Catalasa'
La enzima descompone el peróxido de hidrógeno H2O2
Método: Añadir una gota de H2O2 a un cultivo denso y buscar burbujas (O2)
Utilización mas frecuente Bacillus (+) de Clostridium (-) estreptococcus (-) de micrococcus (-) staphilococcus (+)
* Prueba de “Citrato”
Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en su metabolismo, provocando una alcalinización del medio. Entre las enterobacterias estas características se dan en los siguientes géneros: Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas especies de Salmonella. Sin embargo, Escherichia, Shigella, Salmonella typhi y Salmonella paratyphi son incapaces decrecer con esos nutrientes.
Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Este medio contiene citrato de sodio y fosfato de amonio como fuentes de carbono y de nitrógeno respectivamente y azul de bromotimol como indicador de pH. Sólo las bacterias capaces de metabolizar el citrato podran multiplicarse en este medio y liberaran iones amonio lo que, junto con la eliminación del citrato (acido), generara una fuerte basificación del medio que sera aparente por un cambio de color del indicador de pH, de verde a azul.
* Prueba de Fenilalanina Diseminasa
Esta prueba determina la capacidad de un organismo para desaminar el aminoacido fenilalanina en acido fenilpirúvico por su actividad enzimatica de fenilalanina desaminasa, con la consiguiente acidez resultante. Esta actividad enzimatica es característica de todas las especies del género Proteus y del grupo Providencia por lo que se usa para separar ambos géneros de otras enterobacterias
Se cultiva el microorganismo en agar fenilalanina sembrando la superficie del slant con abundante inóculo e incubando durante 12-16 horas. Seguidamente se añade 0,2ml de una solución de cloruro férrico al 10% de manera que inunde todo el crecimiento. La presencia de acido fenilpirúvico (prueba positiva) se manifiesta por la aparición de un color característico verde oscuro o verde-azulado.

* Prueba de Indol
Mediante esta prueba se detecta la liberación de indol en un cultivo bacteriano. Dicha liberación se debe a la degradación del aminoacido triptófano mediante el enzima triptofanasa.Para la realización de esta prueba la bacteria se cultiva durante 24-48 horas en un caldo de triptona con NaCl al 0 % (la triptona presenta abundante triptófano). Para la posterior detección del indol se usa el reactivo de Kovacs que se puede preparar con los siguientes ingredientes:
* Alcohol amílico o isoamílico (puede sustituirse por alc.butílico)..150ml
* p-dimetilamino-benzaldehído.10g
* HCl (concentrado).50ml
Se disuelve primero el aldehído en el alcohol y después se agrega lentamente a esta mezcla el acido. Para el control de calidad del reactivo se pueden utilizar cultivos conocidos. Las mas convenientes son Escherichia coli (indol+) y todas las especies de Klebsiella (indol-).
Si la bacteria posee la enzima triptofanasa, al añadir al medio 5 gotas del reactivo de Kovacs, se producira un anillo de color rojo en la superficie del caldo y la prueba sera considerada positiva. Si esto ocurre después de 24 horas, la prueba se considera completa, pero si es negativo debera incubarse otras 24 horas y repetirse la prueba. Por ello es conveniente hacer siempre la prueba no en el tubo incubado sino en una porción de unos 2ml que se retira de él asépticamente.
* Prueba de Lactosa
Esta prueba se usa para diferenciar entre las enterobacterias en general y el grupo de las coliformes. Se trata por tanto de una prueba de gran importancia debido a que los coliformes se utilizan como organismosindicadores de contaminación fecal en analisis, sobre todo, de aguas. En bacteriología se define el grupo de organismos coliformes como los 'bacilos Gram negativos, aerobios y anaerobios facultativos, no formadores de esporas y que fermentan la lactosa con formación de gas a 35ºC en 48 horas'. No se trata de un grupo taxonómico e incluye una gran variedad de bacterias, la mayoría de ellas de origen intestinal.
Una manera sencilla de realizar la prueba de la fermentación de la lactosa en enterobacterias es sembrar el microorganismo en agar McConkey, ya que este medio, ademas de selectivo frente a bacterias no entéricas, es diferencial ya que contiene lactosa y un indicador de pH (rojo neutro).
En agar McConkey las bacterias Gram positivas ven inhibido su crecimiento debido a la presencia de sales biliares y cristal violeta y sólo creceran las enterobacterias, pero entre ellas las que fermenten la lactosa (coliformes) liberaran productos acidos que produciran un cambio de pH que se detectara gracias al rojo neutro. Las colonias lactosa (+) apareceran de color rojo o violeta contrastando con la coloración amarillenta de las colonias lactosa (-).
* Prueba de Manitol
Sirve para detectar si los gérmenes son capaces de fermentar el manitol liberando productos acidos que seran detectados gracias al indicador rojo de fenol que cambiara a color amarillo. Para esta prueba el medio manitol movilidad incluye 7 g/l de D-Manita. Bacterias manitol (-) son, dentro de las enterobacterias, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris y Shigella dysenteriae.Entre las bacterias de importancia clínica, la prueba del manitol sirve para diferenciar Staphylococcus aureus (+) de Staphylococcus epidermidis (-)

* Prueba de Movilidad
Sirve para determinar si un organismo es móvil o inmóvil. Las bacterias tienen movilidad por medio de sus flagelos que se encuentran principalmente entre los bacilos aunque existen algunas formas de cocos móviles.
El medio manitol movilidad permite la realización de esta prueba gracias a ser semisólido ya que presenta solamente 3 g/l de agar. En estas condiciones, las bacterias móviles produciran un enturbiamiento homogéneo del medio debido a la distribución aleatoria de los microorganismos. Por el contrario, las bacterias inmóviles permaneceran en la misma línea de la picadura en que se sembraron.
Entre las enterobacterias, la movilidad nos permite diferenciar el género Klebsiella (-) de las restantes que suelen ser movilidad (+).
Dentro del género Bacillus, nos permite diferenciar B.anthracis (-) de otras especies generalmente (+).
* Prueba de la reducción de Nitratos
Sirve para determinar la capacidad de un organismo de reducir el nitrato en nitritos. Para ello, el medio manitol movilidad incorpora 1 g/l de potasio nitrato y para revelar la presencia de nitritos después de su incubación se añaden los reactivos A y B de Griess-Ilosvay en cantidades iguales (1ml aprox.). Un cambio de color (rojo) dentro de los 30 seg indica prueba completa con resultado positivo. Si no cambia de color, se agrega directamente al tubo una pizca (unos 20mg) de polvo de cincpurísimo, totalmente exento de nitratos o nitritos, y se observa el cambio de color durante otros 30 seg, al cabo de los cuales se realiza la interpretación final.
Las enterobacterias son generalmente nitratos (+). Esta prueba se utiliza principalmente para diferenciar entre sí determinadas bacterias de los géneros Haemophylus y Neisseria.
* Prueba de Oxidasa
Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromooxidasa que activa la oxidación del citocromo que es reducido por el oxígeno molecular que produce agua o peróxido de hidrógeno según la especie bacteriana. El oxígeno actúa por tanto como aceptor final de electrones en la cadena transportadora de electrones. Por lo general, el sistema citocromooxidasa sólo se encuentra en los organismos aerobios, algunos anaerobios facultativos y, excepcionalmente, en algún microaerófilo (Vibrio fetus), pero los anaerobios estrictos carecen de actividad oxidasa. Asímismo, la presencia de oxidasa va ligada a la producción de catalasa, ya que ésta degrada el peróxido de hidrógeno que se produce como consecuencia de la reducción del oxígeno y cuya acumulación es tóxica.
La prueba de la oxidasa se usa sobre todo para
* Identificar todas las especies de Neisseria (+)
* Diferenciar Pseudomonas de los miembros oxidasa negativos de las enterobacterias.
El reactivo de la oxidasa mas recomendado es la solución acuosa al 1% de diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (reactivo de Kovacs). Es menos tóxico ymucho mas sensible que el correspondiente compuesto dimetilo (reactivo de Gordon y McLeod), pero es mas caro. Este reactivo tiñe las colonias oxidasa positivas de color lavanda que vira gradualmente a púrpura-negruzco intenso.
Realización de la prueba
1. Método en placa directa
* Agregar directamente 2-3 gotas de reactivo a algunas colonias. No inundar toda la placa y no invertirla.
* Observar los cambios de color. Con el reactivo de Kovacs la reacción se produce en unos 10-15 segundos, mientras que con el de Gordon y McLeod es dentro de los 10-30 minutos.
1. Método indirecto sobre papel
* Colocar un trozo de papel de filtro de 3x3cm aproximadamente en una placa de Petri.
* Agregar 2-3 gotas del reactivo de Kovacs en el centro del papel.
* Extender con el asa de siembra una colonia sobre el papel impregnado.
* La reacción de color positiva se produce a los 5-10 segundos.

* Rojo de Metilo/Voges-Proskauer
Estas dos pruebas forman parte del IMVIC de las colimetrías y permiten la diferenciación dentro de las enterobacterias del grupo coli y aerógenes. Las enterobacterias son anaerobios facultativos que utilizaran la glucosa en dos fases: primero la metabolizaran aerobiamente (respiración oxibióntica) consumiendo rapidamente el oxígeno del medio, para, en segundo lugar, continuar metabolizandola por vía anaerobia (fermentación). Ésta puede ser de dos tipos:
* Fermentación acido mixta: La realizan las bacterias del grupo de E.coli y los productos finales son acidos organicos (acidos fórmico,acético, lactico y succínico) que provocan un fuerte descenso del pH inicial del medio. Puede detectarse por el viraje del indicador de rojo de metilo que permanece amarillo por encima de pH 5 y rojo por debajo de 4,4.
* Fermentación butilén glicólica: La realizan las bacterias del grupo Klebsiella-Enterobacter (antiguo aerógenes). Los productos finales son compuestos neutros como el butanodiol y el etanol, produciéndose acetoína como intermediario que podra ser detectada añadiendo al medio KOH (reactivo A de Voges-Proskauer) y alfa-naftol (reactivo B de Voges-Proskauer) que reaccionaran con este compuesto produciendo un color rojo característico.
Para la realización de estas dos pruebas se cultiva el microorganismo en caldo RMVP (medio de Clark y Lubs) y se incuba a 30ºC durante un periodo de 3 días como mínimo y 5 como maximo. Al revelar las pruebas, se separa el cultivo en dos porciones de unos 2,5ml que serviran para cada uno de los ensayos.
* Rojo de Metilo: A uno de los tubos se le añade unas gotas (4-5) de solución indicadora de Rojo de Metilo. Se agita para homogeneizar y se observa la coloración. Se considera positiva si vira al rojo y negativa si permanece amarillo.
* Voges-Proskauer: A la otra porción de cultivo se le añade:
Si la prueba es positiva, antes de cinco minutos aparece un color rosado-violaceo, mas o menos intenso, que se inicia en la parte superior del tubo. Si la prueba es negativa no aparece coloración alguna.
* Prueba de la Ureasa
Determina la capacidad de un organismo de desdoblar laurea formando dos moléculas de amoniaco por acción del enzima ureasa. Esta actividad enzimatica es característica de todas las especies de Proteus y se usa sobre todo para diferenciar este género de otras enterobacterias que dan negativo o positivo retardado.
Se cultiva el microorganismo en slant en agar urea de Christensen. Este medio se complementa después del autoclavado con 50ml/l de urea. Ésta sera degradada por aquellos microorganismos capaces de producir el enzima ureasa. Esta degradación produce amoniaco que hara variar el color del indicador de amarillo a rojo, poniéndose así de manifiesto la actividad ureasa.
Para revelar el resultado de esta prueba es importante tener en cuenta el tiempo de incubación ya que especies de Proteus vuelven alcalino el medio poco después de la inoculación y sus resultados deben ser leídos en las primeras 2-6 horas, mientras que Citrobacter freundii y Klebsiella pneumoniae tienen actividad ureasa dentro de las 24-48 horas de incubación.
=Morfología Bacteriana=
Las bacterias presentan una amplia variedad de tamaños y formas. La mayoría presentan un tamaño diez veces menor que el de las células eucariotas, es decir, entre 0 y 5 μm. Sin embargo, algunas especies como Thiomargarita namibiensis y Epulopiscium fishelsoni llegan a alcanzar los 0,5 mm, lo cual las hace visibles al ojo desnudo.[41] En el otro extremo se encuentran bacterias mas pequeñas conocidas, entre las que cabe destacar las pertenecientes al género Mycoplasma, las cuales llegan a medir solo 0,3 µm, es decir, tan pequeñas como los virusmas grandes.[42]
La forma de las bacterias es muy variada y, a menudo, una misma especie adopta distintos tipos morfológicos, lo que se conoce como pleomorfismo. De todas formas, podemos distinguir tres tipos fundamentales de bacterias:
* Coco (del griego kókkos, grano): de forma esférica.
* Diplococo: cocos en grupos de dos.
* Tetracoco: cocos en grupos de cuatro.
* Estreptococo: cocos en cadenas.
* Estafilococo: cocos en agrupaciones irregulares o en racimo.
* Bacilo (del latín baculus, varilla): en forma de bastoncillo.
* Formas helicoidales:
* Vibrio: ligeramente curvados y en forma de coma, judía o cacahuete.
* Espirilo: en forma helicoidal rígida o en forma de tirabuzón.
* Espiroqueta: en forma de tirabuzón (helicoidal flexible).

Bacilos Gram Positivos
Los bacilos Gram positivos son cosmopolitas ya que forman esporas, tenemos a las especies bacillus como también esta Bacillus Anthracis, Bacillus cereus.
Los géneros, Bacillus y Clostridium, la mayoría no causan enfermedad y no se han estudiado en la microbiología médica.
Especies del genero Clostridium como también tenemos los Clostridium botulinum, tetani, Clostridium que producen infecciones invasoras y Clostridium difíciles, enfermedad diarreica.

Diagnóstico Microbiológico de Bacilos Gram Positivos y Acido – Alcohol Resistentes
Características generales: Género Mycobacterium. Principales especies en relación con la patología infecciosa humana.
Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis, mecanismospatogénicos: primoinfección, latencia, reactivación, reinfección. Formas anatomoclínicas de la infección tuberculosa. Manifestaciones bucales. Diagnóstico microbiológico. Diagnóstico indirecto de infección: test de tuberculina. Control de la transmisión de Mycobacterium tuberculosis en la clínica odontológica.
Mycobacterium ambientales y oportunistas.
Mycobacterium leprae. Manifestaciones en cavidad bucal

“Bacilos Gram Negativos”
Los bacilos Gram-negativos incluyen un gran número de especies. Algunos de ellos causan principalmente enfermedades respiratorias (Hemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae , Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa), enfermedades urinarias (Escherichia coli, Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens) y enfermedades gastrointestinales (Helicobacter pylori, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi). Otros estan asociadas a infecciones nosocomiales (Acinetobacter baumanii).

. Bases moleculares de los mecanismos de acción. Resistencia, determinantes genéticos. Mecanismos de resistencia. Bases microbiológicas para la utilización clínica de los antimicrobianos.

=CUESTIONARIO=
1. ¿Para que se utiliza la prueba de catalasa?
a) Para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono
b) Descomponer el peróxido de hidrógeno H2O2
c) Detectar la liberación de indol en un cultivo bacteriano
2. ¿La prueba de Fenilalanina Diseminasa para que géneros y grupo se utiliza?
a) Citrobacter freundii y Klebsiella pneumoniae
b)Bacterias del grupo Klebsiella-Enterobacter
c) Especies del género Proteus y del grupo Providencia
3. ¿En que se cultiva el microorganismo para la prueba de citrato?
a) Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons.
b) Se cultiva el microorganismo en agar fenilalanina.
c) En solución acuosa al 1% de diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina
4. ¿Para que sirve la prueba de indol?
a) Detectar la liberación de indol en un cultivo bacteriano
b) Para diferenciar entre las enterobacterias en general y el grupo de las coliformes
c) Para determinar si un organismo es móvil o inmóvil
5. ¿Para que sirve la prueba de movilidad?
a) Sirve para determinar la capacidad de un organismo de reducir el nitrato en nitritos
b) Sirve para determinar si un organismo es móvil o inmóvil
c) Determinar la capacidad de un organismo para desaminar el aminoacido fenilalanina en acido fenilpirúvico

6. ¿Qué enfermedades causan los bacilos Gram positivos?
a) Enfermedades diarreicas
b) Infecciones invasoras
c) Las dos anteriores
7. ¿Qué enfermedades causan los bacilos Gram negativos?
a) Gonorrea, Meningitis
b) Gripa, Tuberculosis
c) Las dos anteriores
8. ¿Qué especies gram negativos causan enfermedades gastrointestinales?
a) Escherichia coli, Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens
b) Helicobacter pylori, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi
c) Hemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae , Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa