INMUNOFLUORESCENCIA

Es una técnica histoquímica o citoquímica que permite la localización e identificación de antígenos y anticuerpos . Consiste en conjugar colorantes fluorescentes con anticuerpos, exponiendo después este conjugado a los anticuerpos o antígenos correspondientes en cortes de tejidos, frotis de microorganismos o de células, o cultivo de tejidos en capa única. Cuando la reacción es positiva y se expone a la luz ultravioleta se producirá fluorescencia observable bajo el microscopio de inmunofluorescencia.



Conjugados  Contenido total de proteina en mg/mL  Unidades precipitantes/mL relación fluorocromo/proteina (F/P)  Titulo final  Debe conservarse en congelación, alicuotado. ˜ Debe estandarizarse para asegurar su buena calidad.

Un buen conjugado debe tener:  Fluorescencia intensa  Reacción específica con los antígenos

Depende de:
Calidad y concentración de los Acs en el suero  Propiedades de la sustancia fluorescente  Modificaciones que ambos pueden sufrir en el acople  Intensidad de marcación  Homogeneidad de marcación  Presencia en el conjugado de otras moléculas marcadas


Anticuerpos Para mayor especificidad utilizar antígenos puros para inmunizar Absorber los antisueros para eliminarAcs indeseables o naturales Purificar la fracción de Ig a marcar Verificar título de anticuerpos Existe un estrecho paralelismo entre título precipitante y fluorescente Titulación de reactivos: Ac 1° y Conjugado deben titularse.

Antígenos  Conocido (sustrato) en pruebas indirectas: debe ser puro y de calidad óptima. ˜ Desconocido en pruebas directas. Liquido de montaje Glicerol 9 partes más 1 parte de buffer pH 7,2.Proporciona viscosidad , reduce el indice de refracción y aumenta la eficiencia cuántica del sistema. Solución salina Se utiliza para los lavados y debe tener un pH 7 .




Portaobjetos  Deben tener un máximo de 1 mm de espesor.  Deben evitar al máximo la fluorescencia inespecífica.

Por el contrario, cuando la glucemia baja, los islotes de Langherans secretan glucagón, que se encarga de estimular al hígado para que aumente su producción de glucosa, y al tejido adiposo que libere ácidos grasos y glicerol como fuentes de energía y material para la síntesis hepática de más glucosa.

Fuentes de glucosa en sangre

1. Ingesta de Hidratos de carbono (dieta).
2. Producción hepática de glucosa
Degradación de glucógeno hepático (el músculo no exporta glucosa)
Neoglucogénesis (en hígado)

Vamos a explicar con detalle, los procesos que se dan en el organismo para mantenerestables los niveles de glucosa en sangre.






2.1 Factores y hormonas hipoglucemiantes. Mecanismos de acción de Insulina.

La disminución de la glucemia está regulada por la insulina. Dicha disminución, se da en fases de saciedad y de absorción de glucosa por las células.

Insulina

La Insulina es una hormona peptídica liberada por las células beta del páncreas de la zona central. Se segrega como pre-hormona. El péptido precursor de la insulina forma la pre-prohormona, después la prohormona y por último la insulina.
La proinsulina cuando se procesa, se rompe y da 3 fragmentos: A, B y C. La insulina se forma por los fragmentos A y B
Se sintetiza como una preprohormona, que en el RE se transforma en proinsulina, la hidrólisis de ésta forma 2 moléculas de insulina y cantidades equimolares de péptido C, ambas se almacenan en los gránulos de secreción. Cuando llega un estimulo apropiado se produce la progresión de los gránulos hacia la membrana plasmática.
Los gránulos se fusionan a la membrana celular y son secretados por exocitosis. La insulina (en forma de monómeros), y el péptido C, difunden hacia los capilares.
Aunque la secreción de insulina está regulada por una serie de complejas señales nerviosas (neuroreceptores), hormonales (gastrointestinales) y nutricionales, la glucosa está considerada como la principal señal de regulación de la secreción de insulina.
La secuencia exacta de acontecimientos implicados en la secreción de insulina no ha sido totalmente identificada, pero se aceptan las siguientes premisas:
Transporte deglucosa al interior celular facilitado por transportadores especializados denominados GLUT, se han identificado un total de 6: GLUT1 GLUT2 GLUT3…GLUT6.
La mayoría de las células metabolizan rápidamente la glucosa manteniendo su concentración baja en su interior.
Los distintos transportadores de glucosa se distribuyen de forma diferente en los distintos tejidos, además distintos tejidos presentan distintas combinaciones de transportadores lo que hace que cada tejido tenga características propias de transporte de glucosa.
De los 6 transportadores el GLUT 1 y el GLUT3 se encuentran siempre en la superficie celular. El GLUT 4 se almacena en el citoplasma en ausencia de insulina y responde a ésta desplazándose a la membrana. Además, ciertos tejidos pueden cambiar la expresión de los transportadores según las circunstancias, por ejemplo, el hígado que expresa GLUT 1 y 3 durante el ayuno.
En las células beta, el transportador más importante parece ser GLUT2, que se asocia a una glucosakinasa (GK) formando un complejo que se denomina sistema sensor de glucosa.

Mecanismo de acción

La insulina debe de unirse a un receptor de membrana de sus células diana y, así, provoca una cascada de segundos mensajeros. El receptor de insulina esta formado por 4 subunidades: 2 beta y 2 alfa unidas por puentes disulfuro.
Las subunidades alfa son completamente extracelulares y es el lugar de unión de la insulina, mientras que las subunidades beta atraviesan la membrana celular y su extremo C terminal está en el citoplasma (presenta actividad kinasa estimulada porla unión al receptor de la insulina).
La unión de la insulina al receptor produce un cambio conformacional y la autofosforilación de residuos de tirosina localizados en la región citoplasmática del receptor lo que produce la propagación de la señal al inte
FLUOROCROMOS MÁS UTILIZADOS
FLUOROCROMO Longitud de onda de absorción (nm) • 374-403 • 494 Longitud de onda de emisión (nm • 422-430 • 520

• Cascade blue • Fluoresceína (FITC) • Rodamina (TRITC) • Naranja de acridina • Yoduro de
propidio

• 540

• 570

• 460-502

• 526-650

El Isotiocianato de fluoresceína (FITC) es una forma de fluoresceína que con facilidad se fija a las proteínas mediante enlaces covalentes a un pH alcalino (residuos de lisina). Su absorción máxima es 490-495 nm y emite un color verde característicoa 517 nm. El FITC es barato, tiene un alto rendimiento cuántico y es relativamente hidrofílico.

• 536

• 617



ï

Inmunofluorescencia Directa (IFD) Inmunofluorescencia Indirecta (IFI)

ï

En esta técnica el antisuero conjugado es añadido directamente al corte del tejido o al frotis . Ejemplo: Detección de antígeno de parásitos como Cryptosporidium sp. , Giardia lamblia , etc

Esta técnica identifica anticuerpos en sueros, siendo el segundo anticuerpo (antianticuerpo) el que esta marcado con el fluorocromo. Ejemplo: Detección de anticuerpos contra Toxoplasma gondii.



INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA

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Diagnóstico bacteriológico, micológico, viral y parasitario. Inmunopatología Investigación de depósitos de complemento , inmunoglobulinas o inmunocomplejos sobre tejidos. Diagnóstico indirecto de enfermedades infecciosas. Diagnóstico de enfermedades autoinmunes. Identificación de subpoblaciones de linfocitos.

(trofozoitos e cerebro)

Naegleria fowleri

Ooquistes en frotis de heces

Cryptosporidium parvun

Cryptococcus neoformans
en sedimento de LCR

INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA

Anti DNA nativo

Anti Toxoplasma gondii

Anti VIH NEGATIVO

Anti VIH POSITIVO