Objetivo
El objetivo de la practica es el estudio, comprensión y dominio de la microscopia de fluorescencia mediante la observación de muestras con el microscopio Olympus BX61

1.-Introducción
La fluorescencia refiere al proceso mediante el cual un espécimen absorbe luz y irradia luz en una longitud de onda menor, en un intervalo de tiempo ínfimo.
Su funcionamiento se basa en la propiedad de fluorescencia que tienen ciertas moléculas denominadas fluorocromos.
Los fluorocromos son sustancias que tienen la propiedad de emitir un fotón de una longitud de onda determinada cuando son excitados por un fotón incidente de una longitud de onda característica. La parte de la molécula que emite la fluorescencia se denomina fluoróforo.
La principal diferencia del Microscopio de Fluorescencia es que permite irradiar al espécimen con la luz de excitación y separar la luz fluorescente emitida, que es mucho mas débil, de la luz de excitación. Así, sólo la luz emitida por el espécimen es detectada por el ojo o el detector (usualmente una camara digital). Como resultado, las partes fluorescentes de la muestra brillan contra un fondo oscuro con suficiente contraste como para permitir la detección. Cuanto mas oscuro es el fondo, mas eficiente sera el instrumento. En la figura 1 se explica lo que ocurre cuando una muestra fluorescente se observa con un microscopio de fluorescencia.

2.-Equipamiento

Microscopio ópticoepi-fluorescencia Olympus Bx61 (Figura 2


El BX61 es un microscopio de investigación completamente motorizado incorporado a la plataforma del estativo vertical tradicional. Todas las funciones principales del microscopio, como el enfoque, la iluminación, la selección de objetivos y la rotación de filtros pueden automatizarse por completo. Todas estas funciones pueden controlarse por computadora mediante un completo software de comandos. El BX61 es una plataforma ideal para sistemas automaticos de generación de imagen que requieren

Automatización de tareas repetitivas.
• Automatización de operaciones complejas y con plazos de tiempo.
• Utilización a distancia mediante redes o Internet.
• Secuencias temporizadas durante horas o días






2.1-Fuentes de luz:

Lamparas de mercurio a alta presión

Son las mas utilizadas. Exhiben maximos discretos sobre un fondo continuo que proporcionan excitación en el rango del ultravioleta así como en las regiones azul y verde y amarillo. Como se puede comprobar en la figura 2.1.

Estas lamparas son caras, requieren unidades de encendido especiales y el coste de funcionamiento es elevado. La salida de la luz se va reduciendo con el tiempo debido al ennegrecimiento del envoltorio de cuarzo. Nunca deben utilizarse mas tiempo del recomendado por el fabricante ya que existe riesgo de explosión que dañaría el microscopio y llenaría la habitación de vaporesde mercurio. Generalmente llevan un contador de horas incorporado.


2.2-Filtros para Fluorescencia

Los filtros juegan un papel muy importante en un Microscopio de Fluorescencia ya que son los que permiten separar la luz emitida de la luz de excitación. Basicamente hay tres categorías de filtros: filtros de excitación, filtros de barrera y espejos dicroicos usualmente combinados para producir un cubo de filtros como el
de la Figura 3. La selección de los filtros apropiados es la clave para que esta microscopía funcione.



Los filtros de excitación permiten que sólo las longitudes de onda seleccionadas de la fuente de luz pasen a través del camino de iluminación del espécimen. Los filtros de barrera o filtros de emisión estan diseñados para suprimir o bloquear (absorber) las longitudes de onda de excitación en el paso hacia el detector. Los espejos dicroicos son filtros especializados diseñados para reflejar las longitudes de onda de excitación y dejar pasar las de emisión eficientemente. Los dicroicos se posicionan en el camino óptico después del filtro de excitación pero antes del de emisión, a un angulo de 45 grados respecto de cada uno de ellos como se puede ver en la figura 3.
El bloque de filtros utilizado para fluorescencia son

BPxxx,yyy - Filtro Pasa Banda (Band Pass): Deja pasar una banda determinada del espectro y bloquea el resto.
 

UV (BP 360-370)




Azul (BP470-490)













Verde (BP530-550)

El resto de filtrosutilizados deja pasar una banda determinada del espectro muy parecida a la verde: Cy3 (BP530-560) y WIY (BP545-580)

2.3-Objetivos Olympus BX61


Representan el componente óptico mas importante del microscopio. Su principal función consiste en colectar la luz proveniente del espécimen y proyectar una imagen nítida, real, invertida y aumentada hacia el cuerpo del microscopio.
Constituyen un sistema óptico formado por una o varias lentes, las cuales deben estar centradas y los ejes ópticos de cada una deben coincidir exactamente para formar el eje óptico del sistema. Sus lentes estan hechas a partir de cristales (espatos, fluorita, entre otros) con un alto grado de calidad y funcionamiento.

Nomenclatura de los objetivos

La identificación de las propiedades individuales de los objetivos es posible gracias a la nomenclatura grabada en la parte exterior y contiene todas las especificaciones necesarias para su uso apropiado (11, 15). La minuciosa información, generalmente en el idioma inglés, puede contener:
• Nombre del fabricante: Casa comercial
• Aumento linear: Con un rango que puede ir desde 0,5x hasta 200x
• Correcciones ópticas: Achro, Achromat (acromaticos); Fluar, Neofluar (semi- apocromaticos); Apo (apocromaticos); Plan, Plano (corrige curvatura de campo); ICS (infinity corrected system), UIS (universal infinity system); N, NPL (normal field o view plan); CF, CFI (chrome-free, chrome free infinity) y muchas otras especificaciones cuya nomenclatura dependedel fabricante.
• Apertura numérica: Es un valor que indica el angulo de apertura del cono luminoso.
• Longitud del tubo: Longitud que separa al objetivo del ocular, usualmente en milímetros (160, 170, 220) o con el símbolo (8) para objetivos con corrección infinita.
• Espesor del cubre-objeto a emplear: Ha sido estandarizada a 0,17mm pero hay diversos espesores lo cual produce aberraciones. Algunos objetivos poseen un collar de corrección en las lentes internas para realizar la corrección y se denominan CR, Corr, w/corr, o pueden tener una escala graduada móvil para el ajuste.
• Distancia focal: Distancia entre el punto focal y la lente frontal del objetivo, expresada en milímetros.
• Propiedades ópticas especiales: En caso de objetivos que en ciertas condiciones tienen resultados óptimos (para luz polarizada, contraste de fase, entre otros).
• Rosca del objetivo: La mayoría de objetivos estan estandarizados de acuerdo a la Royal Microscopy Society para garantizar una compatibilidad universal y se designan con las siglas RMS, sin embargo, algunos fabricantes tiene sus propias dimensiones. El diametro general es de 20mm, pero los objetivos Leica y Nikon son de rosca mas amplia y sólo funcionan en sus microscopios. M25 y M32 designan roscas de 25 y 32 mm respectivamente.
• Medio de inmersión: Algunos objetivos ameritan el uso de medios de inmersión y para ello se emplea un código de colores o las abreviaciones Oil, Oel (aceite); HI (homogeneous immersion); W, Water, Wasser(agua) y Gly (glicerol).
• Código de colores: Algunos fabricantes marcan sus objetivos con anillos de colores para facilitar la identificación del aumento


Los objetivos disponibles para el olympus BX61 lo encontramos en esta tabla






3.-Descripción esquematica de microscopia de epifluorescencia

En la figura 4 se observa un esquema de funcionamiento del microscopio de epifluorescencia. La luz procedente de la fuente (lampara de mercurio o xenón), atraviesa un primer filtro que selecciona la longitud de onda capaz de excitar al fluorocromo, antes de incidir sobre la muestra. Esta luz se refleja en un espejo dicromatico (o dicroico) e incide sobre la muestra, excitando al fluorocromo, el que emite fotones de una longitud de onda mayor que la incidente. La luz emitida por la muestra no se refleja sino que atraviesa el espejo dicroico y llega a un segundo filtro que selecciona la longitud de onda de emisión del fluorocromo. Finalmente, la luz ingresa a un fotomultiplicador que la convierte en una señal eléctrica.






Estudio de imagenes obtenidas en microscopia de fluorescencia

Para la calibración de los sistemas de microscopia de fluorescencia y sistema de evaluación y rendimiento del filtro tenemos una muestra compuestas por esferas de direrentes tamaños en concreto para este caso estudiaremos las esferas de tamaño 6 micras teñidas de verde y azul.

Como ya mencionamos anteriormente una sustancia fluorescente es aquella que es capaz de absorberenergía luminosa, con una determinada longitud de onda, y emitir también luz, que es de una longitud de onda mayor. En la microscopía fluorescente las muestras que se desean analizar son teñidas o marcadas con sustancias fluorescentes, y se iluminan con luz monocromatica de la longitud de onda que activa al marcador (o marcadores, según sea el caso). Luego, con filtros
adecuados, se separan las emisiones incidente y emitida, rechazando la luz reflejada sobre la muestra completa y aceptando únicamente la luz proveniente de las zonas teñidas.


En la figura 5a se puede observar la muestra tipo de esferas teñidas de verde y azul las cuales al ser iluminadas utilizando un filtro UV el cual emite luz en una longitud de onda muy baja permita que la muestra fluorescente emita en los colores teñidos mientras que en la 5b al ser iluminada utilizando un filtro azul la muestra solo puede emitir en una longitud de onda mayor que sera verde y en la 5c que se utiliza un filtro verde la muestra emitira en una longitud de onda menor que la verde en este caso rojo. El color que nos llegue depende de el filtro de emisión, que permite pasar una determinada longitud de onda y no otra.



En la figura 6 y 7 observaremos también con el microscopio óptico dos series de muestras iluminadas con diferentes filtros. Las cuales son un radio de una bici y una moneda de euro.

En ellas observaremos como diferentes zonas de las muestras emiten diferentes fluorescencias al iluminarlos condiferentes filtros (al iluminarlos con una luz de una determina longitud de onda, diferentes zonas emitiran fluorescencia en una longitud de onda mayor, pasando solo la que permita el filtro de emision).





































Bibliografía

https://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MONOWEB/capitulo6_5.htm

https://www.lifetechnologies.com/es/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html

https://www.olympusmicro.com/primer/techniques/fluorescence/fluorosources.html


https://www.olympusmicro.com/primer/java/lightpaths/fluorescence/index.html


https://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MONOWEB/

https://www.olympusmexico.com.mx/spanish/seg/seg_uis2_mirror_uve_esp.asp

https://www.olympuslatinoamerica.com/spanish/seg/seg_product_detail_esp.asp?g=715&s=14&c=54&d=2#

https://iie.fing.edu.uy/investigacion/grupos/gti/timag/trabajos/2007/proteus/epifluorescencia.html

https://ssyf.ua.es/es/formacion/documentos/cursos-programados/2011/especifica/microscopia-optica/microscopia-optica-y-laser-confocal-2a-ed/tema-5.pdf

https://ssyf.ua.es/es/formacion/documentos/cursos-programados/2011/especifica/microscopia-optica/microscopia-optica-y-laser-confocal-2a-ed/tema-4.pdf

https://www.tecnicaenlaboratorios.com/Nikon/Info_fluorescencia.htm

https://www.lifetechnologies.com/es/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html