AISLAMIENTO, IDENTIFICACION Y PURIFICACION DE CEPAS DE LEVADURA
1. GENERALIDADES
1.1 Introducción
La gran demanda de productos obtenidos industrialmente requiere la utilización de ciertos microorganismos cuya dificultad radica en su obtención para elaborar diferentes productos.
Es así que nace la necesidad de contar con técnicas de aislamiento, identificación y purificación de cepas de levaduras, así como la conservación de las mismas para su empleo cuando se lo requiera.
El presente trabajo se enfocara en la búsqueda, estudio y desarrollo de las mejores condiciones para llevar a cabo, dichas técnicas.
1.2 Antecedentes
Existe la evidencia de que el pan era conocido alrededor del año 2600 a.C. en Babilonia, y ya en el siglo 12 a.C. era producido normalmente con una tecnología establecida. Lógicamente esto implica que el hombre dominaba ya el uso de la levadura para levar la masa preparada con harina y producir así el pan.

En las primeras épocas se utilizaba la levadura obtenida de la fabricación de cerveza primero y de las destilerías después, hasta que finalmente se establecieron las plantas de producción de levadura durante el siglo XIX.
Es posible que la primera planta de producción comenzó a operar en Holanda en 1780 con el llamado proceso Dutch que era anaerobio y que tenía sólo rendimiento del 4 al 6% con respecto a la materia prima usada. Posteriormente se mejoró el rendimiento, que pasó a ser del 12-22% con el proceso Vienna, también conducido sin aire, en 1846.
Existen antecedentes en los distintos países vitivinícolas,especialmente en Italia y Francia, sobre ecología y distribución de las levaduras de diversas regiones vitícolas (Minarik, 1978. Strydom ). Delfini, 1985. Caridi . Ciani, 1994. San Romao, 1982. Fleet y Heard, 1993. Ribereau Gayon, 2000). Para el aislamiento de levaduras, estos autores han utilizado muestras de uvas, vendimias estrujadas, mostos en fermentación y vinos en diferentes etapas de su elaboración y conservación.



1.3 Justificacion

El tema a tratar es importante ya que nos ayuda a tener conocimiento sobre cómo identificar, aislar y sembrar a los diferentes tipos de levaduras en el proceso como es la fermentación.
Siendo las levaduras muy importantes para la producción de diferentes productos alimenticios consumidas diariamente, requiriéndose obtener cepas puras de levaduras, para la elaboración de vino
1.4 Objetivos
1.4.1 Objetivos Generales
Se desea aislar , purificar e identificar cepas de levadura
1.4.2 Objetivos Especificos
OBJETIVOS ESPECÍFICOS

ACCIONES
Preparación del mosto
-Estrujar uva sin lavar.
-filtrar
- mosto limpio como minimo 150 ml
- vaciar al Erlenmeyer
- adicionar agua
-cubrir con algodón.

Preparación de agar malta
-en un vaso colocar maltin
- agitar
-adicionar agar
- llevar ebullicion por 2 min
- distribuir 10 ml a la caja petri el cultivo con la ayuda de una pipeta en caliente.
- empaquetar la caja petri con papel madera.
-llevar a autoclave



Aislar cepas de levadura

Realizar diluciones en agar –malta mediante técnicas de extensión y profundidad.
Cultivar y aislar las cepasde levaduras



Purificación de cepas de levaduras

Resiembra para obtención de cultivos puros.
Conocer métodos de purificación

Identificación de cepas de levaduras

Estudio al microscopio
Conocer las diferentes características morfología de las levaduras


Conservación de sepas aisladas
siembra en tubo de ensayo en pico de flauta .
conservación en el tubo.

2.MARCO TEORICO
Definición de levaduras
Se denomina levadura a cualquiera de los diversos hongos microscópicos unicelulares que son importantes por su capacidad para realizar la descomposición mediante fermentación de diversos cuerpos organicos, principalmente los azúcares o hidratos de carbono, produciendo distintas sustancias.
Las levaduras son los agentes de la fermentación y se encuentran naturalmente en la superficie de las plantas, el suelo es su principal habitat encontrandose en invierno en la capa superficial de la tierra. En verano, por medio de los insectos, polvo y animales, son transportados hasta el fruto, por lo que su distribución se produce al azar. Existe un gran número de especies que se diferencian por su aspecto, sus propiedades, sus formas de reproducción y por la forma en la que transforman el azúcar.
Tecnicas de aislamiento
El aislamiento de colonias se lleva a cabo tomando estas con aguja de platino, en las placas en las que se encuentran suficientemente distanciadas. A continuación se transfiere a tubos de ensayo con mosto de uva estéril de 10º Brix.
Después de su incubación a 27ºc durante 48 horas y desarrollo se siembran en tubos con agar demalta inclinado para su taxonomía y posterior conservación
Medios de cultivo para aislamiento de levaduras
Mosto-Malta
Medio Ogga
Solución Ringer
LM (para mantenimiento de colonias

Clasificación de las levaduras
Como criterios de clasificación de levaduras, se sigue el examen de aquellos rasgos que son distintos en los diversos tipos. Los criterios taxonómicos mas importantes utilizados en la clasificación de levaduras son los siguiente
MORFOLOGICOS
Características de la reproducción vegetativa
Gemación
Bipartición
Combinación de los procesos
Características de las células vegetativas
Morfología celular en medio solido
Morfología celular en medio liquido
CULTURALES
Desarrollo en medio liquido. Formación de velo
Desarrollo en medio solido
SEXUALES
Formación de esporas
FISIOLOGICOS Y TECNOLOGICOS
Utilización de compuestos carbonados
Fermentación de azucares
Asimilación de azucares
Hidrólisis de la arbutina
Desarrollo en presencia de etanol
Asimilación de nitratos
Poder fermentativo
Identificación
Los principales criterios utilizados para la clasificación e identificación de las levaduras son los siguientes:
1.- Producción de ascosporas.
Aspecto de las células vegetativas: forma, tamaño, color, inclusiones.
Forma de reproducción asexual.
Producción de micelio.
Forma de película en medio liquido.
Color de la colonia.
Propiedades fisiológicas: producción de acido, actividad ureasica.
Caracterización bioquímica (Frazier y Weathoff, 1998; Hayes, 1993):
-Fermentación de glucosa, galactosa,sacarosa, maltosa, lactosa y rafinosa.
-Crecimiento en 18 sustratos carbonados
Pentosas: D-xilosa, L-arabinosa, D-ribosa, L-ramnosa.
Hexosas: D-glucosa.
Disacaridos: sacarosa, maltosa, celobiosa, trehalosa, lactosa.
Trisacaridos: rafinosa.
Polisacaridos: almidón.
Alcoholes: eritriol, ribitol, D-manitol, inositol.
Acidos organicos: acido succínico, acido cítrico.
-Asimilación de nitratos.
-Crecimiento a 37ºC.
-Crecimiento en medio con vitaminas.
-Producción de almidón.

Purificación
Los procesos de purificación utilizan las técnicas clasicas de fraccionamiento proteico y pueden basarse en el movimiento de sustancias en una fase líquida (electroforesis o filtración en geles) o en la transición de sustancias de una fase a otra (cromatografía o precipitación). La elección de un determinado procedimiento es un problema de prueba y error: hay que probar procedimientos y seleccionar.
En general, la repetición de un paso es ventajoso, ya sea en forma sucesiva o interpolando otros pasos, aunque a veces provoca grandes pérdidas de actividad total. Una vez llevado a cabo un paso satisfactorio, la cantidad de material resultante debe ser manejable antes de pasar al paso posterior.

Aplicaciones
Las levaduras se han utilizado desde hace miles de años en la elaboración del pan y de bebidas como el vino y la cerveza.

Condiciones de conservación
La principal enemiga de la levadura es la temperatura elevada o la muy fría, por lo que es recomendable conservarlasiempre en un lugar mas bien fresco o a temperatura media.
No hay que colocar la levadura en el congelador o freezer, ya que perdera por completo su capacidad de fermentar y leudar.
BIOQUÍMICA DE LAS FERMENTACIONES

Fermentación lactica
En condiciones de ausencia de oxígeno (anaerobias), la fermentación responde a la necesidad de la célula de generar la molécula de NAD+, que ha sido consumida en el proceso energético de la glicolisis. En la glicolisis la célula transforma y oxida la glucosa en un compuesto de tres atomos de carbono, el acido pirúvico, obteniendo dos moléculas de ATP; sin embargo, en este proceso se emplean dos moléculas de NAD+ que actúan como aceptores de electrones y pasan a la forma NADH. Para que puedan tener lugar las reacciones de la glicolisis que producen energía es necesario restablecer el NAD+ por otra reacción. La fermentación lactica también se verifica en el tejido muscular cuando, a causa de una intensa actividad motora, no se produce una aportación adecuada de oxígeno que permita el desarrollo de la respiración celular.
Fermentación alcohólica
La vía de la glucólisis es una secuencia de reacciones catalizadas por enzimas que convierten a la glucosa en piruvato. La conversión de una molécula de glucosa a dos moléculas de piruvato se acompaña de la conversión neta de dos moléculas de ADP en ATP.
La conversión de glucosa a piruvato se acompaña no solo por la síntesis de ATP sino también por la reducción de NAD+ en NADH en la etapa de la gliceraldehido 3 – fosfato deshidrogenasa. Afin de que la glucólisis pueda operar enforma continua, la célula debe tener una forma de regeneración del NAD Esta regeneración se obtiene en anaerobiosis sobre todo por el proceso de la fosforilación oxidativa, el cual necesita oxígeno.
En ausencia de oxígeno (el estado anaerobio), las células de levadura convierten el piruvato en etanol y CO2 en el proceso que oxida el NADH a NAD Participan dos reacciones. Primero el piruvato es descarboxilado a acetaldehído e una reacción catalizada por el piruvato descarboxilasa. En seguida la alcohol deshidrogenasa cataliza la la reducción del acetaldehído a etanol transfiriendo los electrones a partir del NADH.
Fermentación acética
La oxidación de etanol a acido acético es una vía relativamente sencilla por medio de la cual las bacterias acidoacéticas obtienen su energía. Tiene lugar en dos pasos mediados por una alcoholdeshidrogenasa y por una aldehidodeshidrocitoplasmica. Ambas enzimas se hallan asociados a la membrana citoplasmatica y tienen una quinona pirroloquinolínica (PQQ) como coenzima. La PQQ actúa como un aceptor de hidrógeno que después se reduce a citocromo. El consiguiente transporte de electrones crea una fuerza protonmotriz a través de la membrana que puede ser utilizada para sintetizar ATP.
3. MARCO PRACTICO
Preparación del mosto
En un recipiente estrujar una libra sin lavar ( jugo, pepas, cascara)
Filtrar a otro recipiente con media nylon, obteniendo el mosto limpio como minimo 150 ml.
Vaciar a un matraz erlenmeyer y tapar con algodón


Preparación de agar malta
Para 100ml de medio de cultivo agar malta :
100ml demaltin
1,7g de agar
_ en un vaso colocar maltin, agitar para evitar espuma
_adicionar agar
_en hornilla llevara ebullicion por 2 min
_ distribuir 10 ml al tuvo de cultivo con la ayuda de una pipeta en caliente, no es necesario aforar,sea >o< no influye.
_ colocar el tapon de algodón y llevar a autoclave
_y obtendremos en el meson en tubo de flauta
*El maltin tiene 12 Brix en azúcar, lop minimo que se utiliza es 6 Brix poca MO, entonces podemos adicionar agua para bajar a 6Brix pero no es necesario.
Aislar cepas de levadura
Pasado 24 Hrs. de preparacion del mosto
Preparar 5 tubos de ensayo con 9 ml de suero fisiológico
Realizar diluciones, como indica el esquema






Sembrar por extencion y profundidad por triplicado las diluciones

Purificación de cepas de levaduras
Luego de la observación al microscopio y registro trabajar solo con las muestras de levaduras.
Preparar 400ml de mosto con uva previamente lavada.
Filtrar con media nylon a otrp recipiente y hacer hervir.
Repartir de 30 a 35 ml de mosto esteril en frasco individuales tapar y enfriar.
Sembrar una colonia de levaduras de trabajo.
Pasado las 24 horas realizar resiembra por extensión.
Identificación de cepas de levaduras
Observar al microscopio óptico de las características morfológicas de las levaduras.
Identificar cepas puras de levaduras con la misma característica morfológica.
Conservación de cepas aisladas
Sembrar el agar malta en tubos en forma en Pico de Flauta.
Empaquetar los tubos para su conservación.
4. RESULTADOS


5. CONCLUSIONES