CARACTERISTICAS BIOLOGICAS DE LA BACTERIA - MORFOLOGIA

Contenidos:
1. definición
2. Estructura: elementos obligados elementos facultativos
3. tamaño y morfología:
4. Agentes fisicos y qimicos :mecanismo de accion
5. antibioticos y quiomterapicos:???
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1. DEFINICIÓN DE BACTERIA

Las bacterias son organismos unicelulares muy pequeños y relativamente sencillos, cuyo material genético no esta rodeado por una membrana nuclear especial, por ello se llaman procaríotas.

2. ESTRUCTURA BACTERIANA

Las bacterias, son seres unicelulares procariotas y se diferencian de las células eucariótas en que:
- No tiene mitocondrias
- Carece de núcleo organizado
- Presencia de pared celular, etc




Estructuralmente estan constituidos por:
Elementos obligados: estan presentes en todas las bacterias y son indispensables para la vida de la propia bacteria. Son la pared celular, la membrana plasmatica, citoplasma, ribosomas y la región nuclear.
Elementos facultativos: pueden estar o no presentes en la bacteria y son, capsula, flagelos, pelos, endosporas e inclusiones citoplasmicas.

2.1. ELEMENTOS OBLIGADOS

2.1.1. Pared celular

Definición
Es el límite externo de la célula. Tiene una estructura rígida parecida a la pared celular de las células vegetales. Es de gran importancia en el laboratorio de analisis clínico.

Funciones
La pared celular tiene importantes funciones:
Protege a la bacteria de cambios externos adversos.
Ayuda a mantener la morfología de la célula.
Proporciona a la bacteria resistencia a los antibioticos.
Permite el paso selectivo de algunas sustancias.
Proporciona la especificidad de grupo y de tipo en la sistematica bacteriana.
Esta implicada en lapatogenicidad de la bacteria.
Estructura y composición
Las bacterias se han clasificado durante mucho tiempo como bacterias Gram+ y Gram- , en función de su comportamiento frente a la tinción de Gram. El hecho de que se comporten como Gram+ (se tiñen de color violeta oscuro), o como Gram- (color rosa) se debe a su pared celular.


CARACTERíSTICAS BIOLÓGICAS DE LA BACTERIA. MORFOLOGíA

La pared celular de las Gram+ es monoestratificada y esta compuesta por mureína, polisacaridos, proteinas y acidos teicoicos. Baja en lípidos, el peptidoglicano presente formando una monocapa, es un componente importante que supone el 50% del peso seco de algunas células bacterianas.
La pared celular de las Gram- es biestratificada; la primera capa esta constituida por mureína, y la segunda capa esta formada por: polisacaridos, proteínas, fosfolípidos y lípidos. No hay acidos teicoicos. El peptidoglicano esta en poca cantidad.
La mureína, también llamada peptidoglicano, esta compuesta por cadenas de acido N-acetil muramico (NAM)y acido N-acetil glucosamina (NAG) unidas entre sí por puentes peptídicos.
La pared celular de las Gram+ es mas rica en mureína que la de las Gram-.
Existen ademas otras bacterias que no son sensibles a la tinción de Gram, debido a que presentan una pared bacteriana de composición distinta; son las llamadas acido-alcohol-resistentes.
Hay también otras bacterias que no presentan pared celular; unas son las pertenecientes al género mycoplasma (bacterias patógenas), y otras son las bacterias que habitualmente sí tienen pared (formas S) pero la han perdido (formas L).

2.1.2. Membrana plasmatica
Definición
Es una delgada estructura que se extiende por dentro de la pared celular, encerrando al citoplasma dela célula.
Funciones:
Actúa como barrera selectiva.
Interviene en la degradación de nutrientes y en la producción de energía.
En algunas bacterias se encuentran pigmentos y enzimas implicados en la fotosíntesis.
Estructura y composición
Esta compuesta por fosfolípidos y proteínas, aunque también presenta glicolípidos. Los fosfolípidos forman una doble capa que engloba las proteínas globulares que se disponen plegadas de forma irregular.
Mesosomas
Son plegamientos de la membrana plasmatica. Son grandes e irregulares.
No existen en las células eucarióticas. Se encargan de dirigir la duplicación del ADN bacteriano y de realizar la respiración.

2.1.3. Citoplasma

Definición
Es todo lo que hay en el interior de la membrana plasmatica.

Funciones

Engloba los organulos celulares, incluyendo el núcleo, ribosomas, dep de reserva, llamados inclusiones, vacuolas, etc.
Composíción
Formado por un 80% de agua, enzimas, iones y algunos principios inme(

2.1.4. Región nuclear

Definición

Se trata de una zona en el interior del citoplasma bacteriano donde SI mula el acido nucleico.

Funciones

El acido nucleico transmite la información genética de la célula sobre e turas y funciones celulares.
Estructura y composición

Es un núcleo difuso, ya que no esta rodeado de ninguna memb Contiene una única molécula de ADN bicatenario, formando N cromosom

Plasmidos

Ademas del ADN cromosómico pueden existir unas extructuras den e das plamidos formadas por moléculas circulares de ADN extracromos, bicatenario. Ademas:
Replican independientemente.
Pueden transmitirse de una bacteria a otra por conjugación.
Portan genes muy importantes, que determinan actividades como la tencia a antibióticos, tolerancia ametales tóxicos, síntesis de enzima,

2.1.5. Ribosomas

Definición

Son organulos celulares presentes en eucariotas y procariotas. En las rias son muy abundantes, dando aspecto granuloso a su citoplasma.
Funciones
Síntesis de proteínas.
Estructura y composición


Normalmente se encuentran en grupos de 3 ó 4 unidos por un filamento de ARNm, denominados polirribosomas. (Fig. 1.1).


Cada ribosoma tiene dos subunidades de 30 y 50S. La letra S corresponde a unidades Svedberg, e indica la velocidad relativa de sedimentación.


Los ribosomas de células procariotas son de 70S, mientras que los de las eucariotas son de 80S.


En su composición entra a formar parte el ARNr y proteínas de distinta naturaleza.








































2.2. ELEMENTOS FACULTATIVOS



2.2.1. Inclusiones citoplasmicas



A) Definición


Son elementos que aparecen en el citoplasma de las bacterias y que no tienen una estructura uniforme.




B) Funciones
a) Se utilizan como depósitos de reserva.
b) Intervienen en funciones de regulación.
C) Tipos
Hay dos clases:
a) Granulos de reserva, que pueden ser:
* Lipídicos: acumulan lípidos; se tiñen con colorante de Sudan.

* Corpúsculos metacromaticos: acumulan fosfato inorganico. Tienen importante valor diagnóstico para la identificación del Corynebacterium diphtheridae. Se tiñen con azul de metileno.

* De polisacaridos: principalmente glucógeno y almidón. Se tiñen con yodo.
* Granulos de azufre.

* Carboxisomas: contienen una enzima esencial para algunos tipos de bacterias.

a) Vacuolas, constituidas por acúmulos de gases o líquidos rodeados de membranas.

2.2.2. Flagelos

A)Definición

Son largos apéndices filamentosos. Mucho mas frecuentes en los bacilos que en los cocos, donde su presencia es bastante rara.
B) Funciones
Responsables de la movilidad bacteriana.
C) Estructura
Tienen tres partes: filamento, codo y corpúsculo basa!.
D) Tipos de bacterias en función de sus flagelos
a) Monótricas: un solo flagelo en un extremo de la bacteria.
b) Lofótricas: dos o mas flagelos en un extremo de la bacteria.

c) Anfítricos: un grupo de flagelos en un extremo de la bacteria y otro grupo en el otro extremo.
d) Perítricos: flagelos distribuidos en toda la superficie de la bacteria,

2.2.3. Pelos o fimbrias

A) Definíción
Son elementos rígidos constituidos por una proteína.
Son cortos, muy numerosos y estan distribuidos sobre toda la superficie.
Son mas frecuentes en Gram- que en Gram+.
B) Funciones
a) Capacidad de fijación a superficies. La proporcionan los pelos comunes.

b) Sirven también como un sistema de intercambio de información gen ética por conjugación. La proporcionan los pelos sexuales.

2.2.4. Endosporas

A) Definición
Aparecen solo en los bacilos.

Son una forma de resistencia que adoptan algunas bacterias ante situaciones adversas, tales como deficiencia nutricional, desecación, frío, temperaturas elevadas y agentes químicos.

Se forman por un proceso de esporulación o esporogénesis. Pueden permanecer latentes durante cientos de años y volver a una forma vegetativa por un proceso denominado germinación.
B) Estructura
Tiene una estructura muy compleja, constituida por diversas capas.
e) Localización de endosporas
Pueden localizarse en la zona central, subterminal o terminal de la bacteria.
Dependiendo de su tamaño, pueden o no deformar elbacilo.

2.2.5. Capsula

A) Definición

Es la estructura que rodea la pared bacteriana. Se visualiza con tinción negativa (tinta china).
B) Funciones
a) Regula el intercambio de agua, iones y nutrientes.
b) Sirve como almacén externo de nutrientes.


e) Actúa como defensa frente a anticuerpos, fagos y células fagocíticas. De hecho, una bacteria pierde la virulencia al perder la capsula.
e) Por su contenido en agua, protege de la desecación.

f) Permite la formación de colonias, ya que habitualmente una capsula engloba mas de una bacteria.
f) Estructura y composición

Su composición es a base de polímeros glucídicos: acido D-glutamico, glucosa, acido urónico, acido glucurónico y acetilglucosamina; también pueden aparecer polipéptidos.

3. TAMAÑO Y MORFOLOGÍA

3.1. TAMAÑO

Las bacterias son de pequeño tamaño, por lo que para su observación es preciso utilizar el microscopio óptico.
Su tamaño se mide en 11m (0,000001 m) y oscila entre 0,2 y 211m.

3.2. MORFOLOGíA

La morfología nos da una información primaria sobre el tipo de bacteria, pero no de forma concluyente.

Las formas basicas son, esférica (coco), bastoncillo o cilíndrica (bacilo), helicoidal (espirilo), en forma de coma (vibrio), espiral (espiropeta), estrella, y cuadrangular.
Los cocos pueden aparecer:
* Aislados.
* En parejas (diplococos).
* En cadenas (estreptococos).
* En racimos (estafilococos).
* En formas cúbicas de 8 elementos (Sarcinas).
Los bacilos pueden aparecer también:
* Aislados.
* En parejas (diplobacilos).
* En cadena (estreptobacilos).
Algunos bacilos se parecen tanto a los cocos que se llaman cocobacilos.

3.2.1. Morfología bacteriana

La forma de las bacterias viene dada por larigidez de su pared. Hay dos tipos morfológicos fundamentales:
• Cocos: Forma esférica.
- Esferoides, ovoides, lanceolados, reniformes.
- Agrupaciones: Diplococos: dos cocos juntos, como Neíssería
meníngítidis
Estreptococos: cadenas, como Streptococcus pyogenes.
Tetrada: cuatro cocos.
Sarcina: 8 en forma de cubo, como Mícrococcus. Estafilococos: en racimo, como Staphi/ococcus aureus.

• Bacilos: forma alargada.
- Rectos, ahusados, ramificados, curvos, espirales.
- Agrupaciones: Diplobacilos, estreptobacilos, en empalizada.
• Bacterias que no son ni cocos ni bacilos: cocobacilo: Shige//a.

TINCIÓN DE GRAM
1. Muestra fijada de bacterias en un porta.
2. Colorante con violeta de Genciana.
3. Fijador: Lugol (fija el colorante).
4. Decoloración con alcohol-acetona.
5. Colorante de contraste: Safranina.
Las bacterias Gram+ resisten la coloración violeta, mientras que las Gram· se
decoloran y captan el color de contraste. La pared de ambos grupos es diferente.
Técnica:
* Extender, secar y fijar por calor.
* Cubrir la extensión con solución cristal violeta un minuto.
* Lavar con agua destilada y escurrir.
* Cubrir con Lugol un minuto.
* Lavar con agua.
* Decolorar con la solución decolorante 10 segundos hasta que no salga
color violeta.
* Lavar con agua.
* Cubrir la extensión con solución de Saframina un minuto.
* Lavar con agua y dejar secar.
* Observar al microscopio con objetivo de inmersión.
Resultados:
* Gram+: Azul violeta.
* Gram-: rojo-rosado.


Para no dar falsos Gram-, hay que considerar que si la decoloración esexcesiva, puede incluso llegarse a decolorar las Gram+, y que debemos utilizar siempre un cultivo joven.

3.2.2. Estructura bacteriana

La bacteria se diferencia de las células eucarióticas en que:
* No tiene mitocondrias.
* Carece de núcleo organizado.
* Presencia de pared celular, exc:
_ Mycoplasma, es la única bacteria patógena para el hombre que no tiene pared.
- Formas L, bacterias que habitualmente tienen pared, pero pueden per-
derla ocasionalmente.
1. Elementos obligados
* Pared celular.
* Membrana citoplasmatica.
* Espacio periplasmico.
* Citoplasma y organelos.
* Cromosoma bacteriano.
2. Elementos facultativos
* Capsula.
* Flagelos/Pilis.
* Glicocalix.
* Plasmido.
* Esporas.


En el citoplasma se encuentran:
* DNA: cromosoma bacteriano.
* DNA extracromosómico (elemento facultativo. Plasmido)
* Ribosomas.
* Vacuolas.
* Inclusiones.
* Mesosomas (invaginaciones de la membrana citoplasmatica).

1. Elementos obligados

A) Pared celular:

Rígida debido al péptidoglicano (da las características propias de la pared). El péptidoglicano conforma una malla o red que envuelve la bacteria, y esta compuesto por N-acetil glucosamina y N-acetil muramico (+puente peptídico).




Tipos de pared celular:
* Gram +: pared gruesa, homogénea y lisa.
* Gram -: fina, estratificada (tres capas), cerebriforme.
* Acido-alcohol resistentes (resisten la decoloración con acido-alcohol):
estratificada, similar a la Gram +.
Funciones de la pared:
* Esqueleto celular.
* Permite resistir a elevadas presiones (presión osmótica interna> >presión
externa).
* Forma el tabique de separación (división bacteriana).
* Filtro.
*Elemento patogénico: lipopolisacarido.
* Antigenicidad: provoca respuesta inmune.

B) Membrana:
Composición: fosfolípidos, proteínas, colesterol y enzimas (Importante en patogenia. Pueden estar en el espacio periplasmico y son importantes las que tienen acción sobre antibiótico)
Funciones: Membrana funcional que permite el paso de sustancias. Participa en la síntesis de la pared celular.
Mesosomas: Invaginaciones de la membrana. Son septales (participan activamente en la división bacteriana) o laterales (producen almacenamiento, enzimas).

C) Citoplasma:
Composición: igual que en las células. eucarióticas, excepto que no tienen mitocondrias.
* Ribosomas: síntesis proteica (mas pequeños que los eucariotas).
Sintetizan proteínas y RNAr.
* Inclusiones: vacuolas (almacenan elementos gaseosos o líquidos).
Granulos (elementos sólidos, polifosfato, glucógeno, ac. poli-I:S-butírico, lípidos, azufre.)
D) Cromosoma bacteriano:
DNA: circular, en forma de anillo. Único. (Bases púricas A, G, pirimidínicas T, C.) Funciones: Expresión de las características genéticas.
Mecanismos de transferencia gen ética. División bacteriana.
Síntesis protéica.

2. Elementos facultativos
A) Capsula:
Elemento muy voluminoso que puede englobar mas de una bacteria.


Composición: polisacaridos y proteínas.
Funciones: Resistencia a la fagocitosis directamente relacionada con la. actividad patógena, que protege de la antigenicidad.
Resistencia a antimicrobianos. Alteración de antígenos bacterianos.
B) Pilis o fimbrias:
Filamentos rígidos e inmóviles, de naturaleza proteica (pilina).
Funciones: Pilis comunes: muy numerosos, adherencia a superficies (endotelios), acción patógena.Pilis sexuales: escasos, intercambio de información genética.
C) P/asmidos:
DNA extracromosómico.
Características: información genética diferente al cromosoma bacteria no Autorreplicables
Transmisión hereditaria (no obligado)
Transmisión interbacteriana a través de pilis sexuales
1°) Replicar el plasmido.
2°) Gen que codifica la síntesis de un pili sexual (factor sexual)
El plasmido puede estar libre en el citoplasma o integrado en el cromosoma bacteria no (episoma),
Fenómenos: recombinación,
Curación: pérdida del plasmido en el proceso de división bacteriana.
Transferencia
Movilización: una bacteria tiene dos plasmidos y sólo uno tiene codificado el factor sexual. Este se transfiere a otra bacteria y arrastra en su movimiento al plasmido que no puede transferirse.
Tipos: dependiendo de la dotación genética:
Sexuales
De resistencia (a antimicrobianos)- comunicación entre las bacterias. Determinantes de factores patogénicos (toxinas, capsula)
Codificado res de funciones metabólicas
Factores COL: síntesis de bacteriocinas con capacidad antibiótica.

D) Esporas:
Mecanismos de resistencia al medio ambiente.
Resistencia a: temperatura pH, radiaciones, desecación, déficit nutricional, altas presiones y agentes químicos.
Consiste en una bacteria sin agua y rodeada de muchas capas.
Una característica única de las endosporas bacterianas es su dotación química: todas contienen acido dipicolínico, ausente en las formas vegetativas; contiene también calcio y el complejo formado por Ca-acido dipicolínico-peptidoglicano constituye la capa cortical. La espora madura es capaz de formar una célula vegetativa. Lospasos a seguir son los siguientes: 1) Activación de la espora por el calor o el envejecimiento. 2) Germinación. 3) Crecimiento para dar una célula vegetativa.
La localización dentro de la célula de las endosporas y el tamaño, es distinto dentro de las diferentes especies bacterianas. Algunas esporas se forman en el medio de la célula, son centrales; otras se forman en el extremo, son terminales; otras se forman a corta distancia de un extremo, son subterminales; y el diametro de la espora puede ser mayor o menor que el de la célula. Por ello se utilizan estas características: tamaño, la presencia de la espora, su localización para clasificar e identificar a las bacterias.






Localización tamaño y forma de distintas especies de C/ostrídíum y Baci//us:


|Central |Subterminal |Terminal |
|Baci//us cereus |C/ostridium |C/ostridium tetani |
|Esporas elípticas |subtermina/e |Esporas esféricas |
|localizadas |Esporas ovaladas |localizadas |
|centralmente |con localización |terminalmente |
subterminal


E) F/age/os:
Elemento de movilidad, es un filamento flexible y móvil (protección contractil: flagelina).
Partes: Corpúsculo basal- Elemento de anclaje.
Filamento.
Codo: une ambos.
Tipos: Monótricos: un flagelo polar.
Logótricos: varios flagelos en un polo. Anfítricos: varios flagelos en dos polos. Perítricos: flagelos en toda la superficie.

3.2.3. Nutrición y cultivos bacteria nos

A) Distribución:

Lasbacterias necesitan obtener energía y sustancias para construir su cuerpo. Fuente de energía:
* Fotótrofas: fotoorganótrofas y fotolitótrofas .
* Quimiótrofas: quimioorganótrofas y quimiolitótrofas.

Capacidad de síntesis:
* Autótrofas (sintetizan todo): estrictas (a partir de sustancias mínimas) o facultativas (con otras bacterias)
* Heterótrofas: protótrofas (sintetizan componentes esenciales) o autótrofas (utilizan factores de crecimiento)

B) Nutrientes:

* HzO
* lones
* Carbono
* Oxígeno: Aerobias obligadas (lo necesitan)
Anaerobias estrictas (Oz tóxico)
Anaerobias facultativas
Microaerófilas (Oz en pequeñas cantidades, pero necesario)
* COz
* Factores de crecimiento organicos: vitaminas, purinas/pirimidinas, aminoacidos, hemoglobina.

C) Medios de cultivo:

Conjunto de nutrientes con determinadas condiciones ambientales que le permiten crecimiento y reproducción.
Aporta: Fuente de carbono y nitrógeno, elementos minerales, factores de crecimiento, HzO y pH adecuado.

Los medios de cultivo son necesarios para conocer la bacteria infectante, para hallar muestras de flora saprófita (bacterias infectantes) y conocer bacterias con necesidades especiales.

Tipos de medios:
* Sólidos o líquidos: agar-agar.
* Comunes-enriquecidos: agar-sangre (de carnero).

* De enriquecimiento: medio líquido que permite la proliferación rapida de patógenos y las bacterias 'buenas' no crecen. Ej: medio de selenito (recupera las bacterias de las heces).
* Específicos (determinados para una bacteria)
* Diferenciales (resaltan una cualidad de la bacteria), como los indicadores de pH.
* De transporte
* De conservación.
* En células vivas.* Selectivos (sólidos, Utilizan pH, presión osmótica, antisépticos y antibióticos).

Siembra en medio sólido:

Tomar una muestra clínica de un individuo enfermo; se obtienen muestras de donde puede estar la bacteria.
Frotis: se usa una torunda o hisopo (palillo de oídos), ej. amígdalas, vagina.
Depende de la muestra y del medio.
1) Placa
Depende de donde se ha obtenido la muestra:

* Medio líquido: se coge un poco y se pone en un punto de la placa, extendiéndose con un asa de platino por una cuarta parte de ésta (una descarga y luego se quema el asa) Desde otro pico se hace otra descarga y así hasta que se cubra la superficie. Siembra por agotamiento.
* Medio sólido: se toma una colonia y se repite el proceso.
* Frotis: la primera descarga es de la torunda y el agotamiento se hace con un asa de platino.
Cuando la muestra es de orina o de biopsia:
a) Orina: igual que en medio líquido.
b) Biopsia: Se hace pasar a medio líquido y sigue los mismos pasos
2) Tubo
Se hace en 'pico de flauta':
* Superficie: Descarga en zig-zag en el pico de flauta.
* Picadura: Se inocula con un pincho hilo.
Siempre se dan los dos a la vez.

Siembra en medio líquido
* Muestra líquida: sólo se mezcla.
* Muestra sólida: se toma una colonia y se diluye.
* Muestra clínica:
- Frotis: se introduce la torunda en el medio líquido y se deja allí.
- Muestra líquida: se diluye y se mezcla.
- Muestra sólida: se mete en el medio de cultivo.

Características del cultivo a) Temperatura:
Mesófilos: crecen entre 20-40 °C (óptima en 37 °C). Psicrófilos: temperatura 40 °C.
b) Tiempo:
Crecimiento rapido (horas) Crecimiento lento (semanas, meses) Los patógenos suelen crecer en 24h.
e)Atmósfera:
Aerobia, anaerobia o microaerófila. Algunas bacterias necesitan CO2.
d) Luz:
En oscuridad crecen mejor. e) Humedad:

El agar lleva cantidad suficiente de humedad; si es necesario se da vapor de agua.




Flora bacteriana


Pie

Conjuntiva
Vías respiratorias superiores Tracto gastro- intestinal Genitales externos
Vagina
Uretra anterior
Conducto auditivo externo
|++ |Gram +, anaerobios |
|+ |Gram + |
|+++ |Gram +, anaerobios (c. o.), Gram- |
|+++ |Gram-, anaerobios, Gram + |
|++ |Anaerobios, Gram-, Gram+ |
|++ |Anaerobios, Gram-, Gram+ |
|+ |Anaerobios, Gram-, Gram+ |
|++ |Gram+ Gram- |
Localizaciones estériles:

* Líquidos corporales: sangre, linfa, LCR, líquido sinovial, bilis, líquido peritoneal y orina (la orina es estéril, no así los genitales externos)

* Cavidades: aparato urinario, senos, cavidad pleural, oído medio y vías respiratorias inferiores .
* Tejidos corporales.


D) Diagnóstico:

Un cuadro clínico infeccioso puede ser vírico y/o bacteriano.

El diagnóstico de bacterias puede ser directo o indirecto. El diagnóstico directo tiene una serie de dificultades que son:
a) Existencia de flora normal saprófita que dificulta el diagnóstico de los
patógenos.
b) Bacterias que son patógenos oportunistas
c) Contaminación de las muestras clínicas.

El diagnóstico indirecto trata de poner de manifiesto una reacclon del Sistema Inmunológico ante bacterias mediante la búsqueda del Anticuerpo o reacción de sistema inmunológico. Hay dostipos de pruebas: serológicas (buscan Anticuerpo) o dérmicas (ponen de manifiesto una reacción inmunológica)
Procedimiento a seguir con las muestras clínicas
Producto patológico o no, obtenido del enfermo, donde se va a aislar la bac-
teria
1) Elección (lugar mas adecuado para la localización).
2) Obtención (criterios y normas)
3) Transporte y conservación.
4) Datos del enfermo.

a) Datos del enfermo
* Tipo de muestra enviada: - Momento de la toma
- Condiciones de extracción
- Condiciones de conservación y transporte
* Nombre y dos apellidos
* Sexo, edad y domicilio
* Servicio o consulta
* Diagnóstico de ingreso o consulta
* Diagnóstico o síntomas que sugieren el estudio
* Antecedentes personales
* Administración de antimicrobianos previos y/o posteriores

b) Tipo de muestra
• Sangre: Preparación de piel Volumen de sangre
Siembra inmediata o conservante Medios para aerobios y anaerobios
Bacteriemia: Continua (sepsis, endocarditis, específicas) Intermitentes (meningitis, neumonías)
• Infección SNC: Punción lumbar
Biopsia
• Infecciones abdominales: Punción (líquido peritoneal) Laparotomía
• Infecciones osteoarticulares: Punción
Biopsia
* Abscesos: Drenaje
* Infecciones de la piel: Raspado
Recogida de exudados Biopsia
Tracto gastrointestinal

• Infecciones Tracto grastrointestinal: Muestra: heces (elegir zona con moco, sangre o pus)
Retraso en la siembra: Solución tampón o refrigeración
• Infecciones de genitales externos:
- Varones: Raspado uretral Descarga uretral
- Hembras: Frotis endocervical
Toma rectaly faríngea (siembra inmediata o medio de transporte) • Vías respiratorias altas: (frotis)
Nasofaringe: Difteria, HéEmophilus influenza e
Orofaringe: Faringitis estrepto y gonocócica, tosferina y difteria.
• Vías respiratorias bajas: Esputo
Esputo inducido mas lavado gastrico Aspirado nasotraqueal
Lavado o cepillado bronquial Aspiración transtraqueal percutanea Biopsia pulmonar percutanea
Biopsia a pulmón abierto Toracocentesis

• Estudio microbiológico:
1. Examen microscópico: tinción de Gram y examen en fresco. Se ven las colonias, su forma, tamaño, color, consistencia, etc.-; algunas bacterias tienen pigmentos.
2. Pruebas específicas: Bioquímicas; pruebas de crecimiento o tolerancia -frente a antisépticos, colorantes y CINa; sensibilidad a antibiótiicos, movilidad, técnicas de identificación serológica (determinación de diferentes antígenos en la bacteria)


3.2.4. Genética bacteriana

La información genética de las bacterias se encuentra contenida en la secuencia de nucleótidos del ADN cromosómico. Las modificaciones que pueden aparecer en los caracteres bacterianos pueden afectar a su fenotipo (adaptaciones condicionadas por el ambiente) o a su genotipo (mutaciones y fenómenos de transferencia genética). Las variaciones fenotípicas son modificaciones debidas a cambios ambientales, sin relación con el genoma, y no son transmisibles hereditariamente.

1. Mutaciones

Son cambios espontaneos, irreversibles y hereditarios de un caracter de la bacteria y no dependientes de la incorporación de material genético de otro organismo. En una colonia casi siempre se produce alguna mutación: la bacteria con las propiedades originales se denominasalvaje y la que varía con respecto a ella, mutante.
Bioquímicamente son alteraciones en la secuencia de nucleótidos del ADN cromosómico o extracromosómico, lo que lleva a la producción de proteínas que tienen alterada su secuencia de aminoacidos y pueden influir en la función a la que se destinan.
Las mutaciones se caracterizan por:
* Baja frecuencia: una colonia bacteriana contiene una pequeña proporción de mutantes.
* Especificidad: cada mutación afecta normalmente a un caracter determinado. Si se produce en un solo nucleótido se llama puntual
* Estabilidad: son hereditarias. Sólo se revierten por otra mutación.
* Espontaneidad: la mutación se produce de forma independiente a las características que codifica el gen mutado.
Las mutaciones pueden ser incrementadas por los agentes mutagenos, como son las radiaciones UVA o ionizantes, factores antineoplasicos, agentes alquilantes.
Cuando una mutación coincide con un tratamiento antibiótico, puede afectar al tratamiento, de forma que haya una bacteria resistente al antibiótico y se multiplique.
Las mutaciones puntuales se producen por sustitución, inserción, adición o pérdida de un nucleótido.

2. Fenómenos de transferencia genética

Procedimiento por el que una bacteria adquiere genes que antes no tenía, procedentes de otra bacteria o de un virus DNA.



a) Transformación: la bacteria toma ADN exógeno procedente de la lisis de otra bacteria y lo integra en su cromosoma (que en ese momento se llama competente). Esta capacidad no la tienen la gran mayoría de las bacterias porque poseen unas endonucleasas de restricción que destruyen el genoma extraño, pero hay bacterias que son capaces de integrar ADN exógeno siempre que sea 'homólogo' al propio(Streptococcus pneumoniae)

b) Transducción: se transfiere un fragmento de ADN de una bacteria a otra, por intermedio de un bacteriófago, lítico o atemperado, cuyo acido nucléico es ADN bicatenario .

* Transducción generalizada: un virus lítico infecta una bacteria, se reproduce e induce la lisis de la bacteria. Cuando el virus se ensambla puede adquirir fragmentos del cromosoma de la bacteria infectada, y transferir éstos cuando infecte otra bacteria. El fragmento de ADN se incorpora al de la célula huésped. Puede darse una transducción abortiva si el fragmento transferido no se integra en el cromosoma y no se replica con él, de modo que sólo pase a una de sus células hijas.

* Transducción restringida: provocada por un fago atemperado. Cuando se induce la bacteria lisogénica y el profago se transfiere en fago atemperado, puede arrastrar un fragmento del ADN bacteria no vecino y transmitirlo a una nueva bacteria.

a) Transfección: inoculación de un ADN obtenido de un virus a una bacteria para que se integre en el cromosoma bacteriano. Es un procedimiento artificial para obtener productos genéticos.

b) Conversión: integración de un ADN fagico en el cromosoma bacteriano (profago -virus atemperado-), que codifica una serie de caracteres nuevos para la bacteria.

c) Conjugación: es la transferencia de material genético cromosómico o no, de una bacteria donante a una receptora por contacto directo de ambas mediante un pili sexual. El ADN que se transmite puede ser cromosómico o extracromosómico, y la capacidad de actuar como donante se debe a la presencia de un plasmido transmisible que contiene la información para la formación de pili y para transferir el ADN a la bacteria receptora (factor de transferencia o factor sexual).Así, las bacterias que lo tienen son F+. Se dan tres casos:

1°) El factor F es un ADN extracromosómico bicatenario y circular (plasmido), que lleva información genética que permite su replicación y la formación de pili para transferirse a otra bacteria. En la conjugación de una bacteria F+ con una F-, el factor F libre en el citoplasma de la primera induce la formación de pili y pasa a la segunda tras su replicación, de forma que finalmente las dos bacterias son F+.

2°)EI factor F del plasmido se integra en el cromosoma bacteriano, y la bacteria tiene capacidad de transferir genes cromosómicos a bacterias F-. Este tipo de bacterias se llama Hfr (alta frecuencia de recombinación). El factor F se replica con el cromosoma sin perder su capacidad de producir pili sexuales. Durante la conjugación de una Hfr con una F-, se forma el pili y una réplica del ADN cromosómico pasa a la bacteria receptora. La rotura tiene lugar por el factor F y comienza el paso de material genético por el lugar opuesto. Como el paso entero de toda la réplica es muy largo, normalmente no se transmite el factor F, con lo que la bacteria receptora sigue siendo F-.

3°) En algunas cepas Hfr, el factor sexual puede separarse de nuevo del ADN cromosómico y llevarse consigo algunos genes de la bacteria. En el momento de la conjugación, se forma el pili y se transfiere el plasmido con los genes que se lleva, y la bacteria receptora pasa a ser F+ y con otras características del cromosoma bacteriano.

4. AGENTES FíSICOS Y QUIMICOS

Las circunstancias físicas y químicas en las que los microorganismos se encuentren tienen una influencia favorable o desfavorable decisiva en su crecimiento y desarrollo.

4.1. AGENTES FíSICOS

Los agentes físicos que masinfluencia tienen en la fisiología de los microorganismos son, la temperatura, la humedad, las radiaciones y los agentes mecanicos.

a) Temperatura

Los sistemas enzimaticos de las bacterias tienen una temperatura óptima; por encima y por debajo de ésta las bacterias siguen viviendo dentro de amplios margenes (temperatura maxima y mínima). Por su temperatura óptima de crecimiento, las bacterias pueden ser: psicrófilas (O-20°C), mesófilas (20-45 °C) o termófilas (>45 0c).
• Acción del calor

PTM: Punto Térmico Mortal, temperatura mínima a la que se puede destruir una suspensión bacteriana en 10 minutos.

TTM: Tiempo Térmico Mortal, tiempo necesario para matar las bacterias o esporas a temperatura constante, teniendo en cuenta el caracter del medio y otros datos.
El efecto destructivo del calor sobre las bacterias esta en relación con el grado
de humedad del ambiente, así se distingue entre calor húmedo y calor seco.

Calor húmedo: Tiene un efecto mayor sobre las bacterias, porque el agua es un buen conductor. Destruye los microorganismos por coagulación y desnaturalización de las estructuras protéicas y enzimas.


- Ebullición: a 100°C aplicados durante 10-30 minutos, destruye todas las formas vegetativas de las bacterias.
- Pasteurización: aplica el calor 30 minutos a 63°C, con lo que consigue la destrucción de todas las formas vegetativas, a excepción de las termófilas.
- Tindalización (calentamiento intermitente): consiste en someter al producto durante tres días consecutivos a un calentamiento entre 56 y 100 °C durante media hora. En los intervalos a temperatura ambiente, los esporos germinan y las bacterias resultantes de ellos se hacen sensibles al calentamiento posterior, con lo quese destruyen todas las formas.
- Vapor de agua a presión: técnica de destrucción de bacterias muy efectiva. A una atmósfera de presión corresponde a 121°C; esta temperatura aplicada durante 15-20 minutos, o 134°C durante 7 minutos, destruye todas las formas vegetativas y esporuladas.
Calor seco:
- Flameado: quemado en llama.
- Incineración: proceso de esterilización de productos cOntaminados,
mediante combustión directa o en el horno crematorio.
- Calor seco por aire caliente: Se logra la esterilización enunab.ora a 160 °C, 40 minutos a 170°C o 20 minutos a 180°C. El horno Pastel;lrgenera corrientes forzadas de aire que son eficaces para destruir los microorganismos.
• Acción del frío:

Las bacterias son difícilmente destruidas por el frío, se considera que las bajas temperaturas impiden la multiplicación bacteriana, aunque son un medio de conservación.
b) Humedad

Las bacterias necesitan un grado de humedad adecuado para su desarrollo, lo que esta en relación con la concentración de sales. Así, en un medio hipotónico, pasa agua desde el medio al interior de la bacteria, pero en general la bacteria no estalla gracias a que la pared resiste presiones superiores a las que se alcanzan en el interior de ellas. Por el contrario, cuando el medio es hipertónico, pasa agua de la bacteria al medio, de modo que se retrae el citoplasma (plasmolisis) y la bacteria muere o queda latente, a excepción de las bacterias osmófilas,

Por la desecación se inhibe el desarrollo de muchas bacterias y puede producir la muerte de muchas de ellas, quedando sólo los esporos y las mas resistentes, como Staphylococcus o M. tuberculosis.
c) Radiaciones

* Radiaciones UVA: los procesos bactericidas de los rayosUVA son múltiples; por un lado alteran las bases púricas y pirimidínicas del ADN, por otra, producen ozono en contacto con el aire y éste actúa sobre las bacterias; y, finalmente producen agua oxigenada, nociva para las bacterias.

* Radiaciones ionizantes (Rx y R) Y gamma: Inactivan el genoma bacteria no y la bacteria muere. Permiten la radioesterilización o esterilización en frío.
d} Sonido

Las ondas ultrasónicas se usan para romper bacterias y obtener los antígenos, enzimas, etc., (sonicación)
e) filtración

Consiste en hacer pasar líquidos por un material con poros mas pequeños que las bacterias. Se emplean laminas de amianto o de acetato de celulosa con porosidad uniforme. Los filtros HEPA son muy eficaces y se emplean en unidades de aislamiento (con corriente de aire y presión negativa), útiles para prematuros, quemados, etc.

4.2. AGENTES QUíMICOS

Se usan desinfectantes y antisépticos; los desinfectantes son aquellas sustancias capaces de destruir en 10-15 minutos los gérmenes depositados en un material inerte o vivo. Los antisépticos son las sustancias que se oponen a la existencia o desarrollo de gérmenes sobre la piel o mucosas, heridas, abrasiones, etc.
a} Inorganicos: tienen efecto sobre las bacterias por su acción oxidante o disolución de ion es.

* Acidos y alcalis: el efecto esta en relación con el grado de disociación, ya que las bacterias pueden vivir con un pH variable (óptimo 4-9) y mueren en medios muy acidos o muy basicos.

* Sales minerales: tienen efecto bactericida, sobre todo las sales de plata o mercurio. El mercurocromo, el mertiolato o el merfén son desinfectantes de la piel y también conservantes de productos biológicos.

* Oxidantes: Los mas usados son loscompuestos halogenados, sobre todo el cloro y el yodo. El yodo se usa en solución alcohólica, tintura de yodo o en soluciones acuosas combinadas con compuestos organicos (povidona yodada) o detergentes.
b} Organicos:

* Alcoholes: el alcohol etílico tiene poder deshidratante y desnaturalizante sobre las proteínas bacterianas.

* Fenoles: desinfectante que mata en pocas horas casi todas las bacterias (excepto hongos y virus), en concentraciones de 2-5%0, pero se usa poco por su toxicidad y olor.


- Biguanidinas: grupo de fenoles activos a concentraciones del 1 %. Útil en la prevención de infecciones hospitalarias y lavado de superficies cutaneas. No irrita los tejidos.

* Formaldehído y glutaraldehído: el primero es un desinfectante que actúa coagulando las proteínas bacterianas. El segundo es esterilizante, ya que destruye las formas vegetativas de las bacterias, así como sus esporos y los virus.

* Colorantes: algunos (azul de metileno, verde brillante) tienen una acción selectiva bacteriostatica o bactericida según la concentración. El violeta de genciana se usa para desinfectar la cavidad bucal.
* Detergentes.
* Desinfectantes gaseosos.

4.3. MECANISMO DE ACCiÓN

a} Agentes que actúan sobre la membrana citoplasmica y la pared celular. b) Agentes que actúan sobre las proteínas y enzimas: coagulación, toxicidad y formación de radicales libres.
c} Agentes que actúan sobre el núcleo: interfieren en la replicación del ADN.








6. FACTORES DETERMINANTES DE LA ACCIÓN PA TÓGENA

Las bacterias para poder manifestar su acción patógena deben ser capaces de:

1. Llegar a la superficie del huésped por una puerta de entrada, colonizar el epitelio y resistir los sistemas locales de defensa:capacidad de colonización.

1. Atravesar la barrera cutaneo-mucosa para alcanzar los tejidos subepiteliales y contactar con el medio interno: capacidad de penetración.

2. Multiplicarse en los tejidos del huésped, interfiriendo con los mecanismos defensivos de éste, lo que les permite establecerse e invadir el organismo: capacidad de multiplicación e invasión.

3. Producir alteraciones y lesiones en las células del huésped, responsables de un cuadro patológico: capacidad lesional


6.1. COLONIZACiÓN

A) Bacterias que proceden del exterior y penetran en el organismo por una puerta de entrada (piel, mucosas).
B) Bacterias endógenas de la flora microbiananormal.

6.1.1. Interacciones en el epitelio cutaneomucoso

Mecanismos de las bacterias patógenas para evitar la acción de las defensas locales:

1. Enzimas (mucinasas, neuraminidasas) que descomponen las glicoproteínas del moco y facilitan la penetración.

2. Factores de superficie (capsula, Antígeno de pared) que inhiben la fagocitosis y la acción de los bactericidas.

3. Proteasas, enzimas proteolíticas que descomponen las IgA (sistema local de defensa).

4. Bacteriocinas y otras sustancias inhibidoras y bactericidas para competir con la flora normal.

6.2. ADHERENCIA

Propiedad de las bacterias que les permite fijarse a la superficie de las células.

6.2.1. Adhesinas

Compuestos en la superficie de las bacterias que actúan de mediadores en el fenómeno de adherencia.

a) Bacterias Gram -: las adhesinas se encuentran en la superficie de las fimbrias o en otras estructuras de la membrana externa.

b) Bacterias Gram +: la adherencia se encuentra asociada a la presencia de acido lipoteicoico, glicocalix y otras estructuras en la superficiede la bacteria.

6.2.2. Receptores

Compuestos en la superficie celular que combinan específicamente con las adhesinas bacterianas.
Las moléculas de adhesina pueden presentar configuraciones complementarias a los receptores celulares, y combinarse con éstos de forma esteroespecífica y estabilizar la colonización.
La adherencia depende en gran parte de la distribución de los receptores en el organismo, ya que la mayoría de las bacterias presentan un cierto tropismo ante una célula o un tejido concreto (especificidad o tropismo celular). También es importante la densidad de receptores en las células del organismo (receptores por superficie).
La adherencia de las bacterias patógenas al epitelio evita su eliminación por los factores mecanicos y facilita su desarrollo y multiplicación. La capacidad de adherencia es uno de los factores determinantes de la acción patógena , pero no constituye un factor indispensable para la infección.
Las bacterias también pueden adherirse a los macrófagos, lo que favorecería su fagocitosis. Pero pueden evitarlo por dos mecanismos:
1. Síntesis de capsulas o capas mucosas que enmascaran las adhesinas.
2. Represión de la expresión de las adhesinas (variantes no fimbriadas).

6.2.3. Prevención de la adherencia

Inhibidores de la adherencia: administración de analogos de bajo peso molecular de las sustancias que intervienen en la adhesión (especialmente del carbohidrato receptor).
Antimicrobianos: inhibidores de la síntesis proteica (tetraciclinas, aminoglicósidos, cotrimoxazol) o los que modifican la pared celular (lS-lactamicos).
Vacunas

6.3. PENETRACiÓN

1. Bacterias sin capacidad de penetración: no precisan atravesar el epitelio para ejercer su acción patógena (puedenproducir exotoxinas de acción local).
2. Bacterias con capacidad de penetración pasiva: atraviesan el epitelio por mecanismo pasivo.

a) A través del epitelio intacto: consecuencia de la picadura de un artrópodo vector (directamente a sangre o al tejido celular subcutaneo).

b) A través del epitelio modificado (heridas, quemaduras) o alteraciones de la flora normal.
3. Bacterias con capacidad de penetración activa: mecanismo semejante a la fagocitosis. Los determinantes del poder patógeno estan relacionados
con la presencia de determinados factores codificados por el cromosoma o plasmidos. Codifican la síntesis de proteínas o polipéptidos que induciran el proceso endocítico.

6.3.1. Modalidades de infección según la capacidad de penetración

Las bacterias sin capacidad de penetración se multiplican en la superficie del epitelio y colonizan las mucosas, siendo la enfermedad resultante de una toxina soluble que difunde local o generalmente. Las bacterias que penetran en las células epiteliales destruyen el epitelio y no afectan al tejido celular subcutaneo. Las bacterias que llegan a la submucosa se multiplican y difunden en el organismo, dando lugar a procesos localizados o generalizados.

6.4. MULTIPLICACiÓN

Una vez que han atravesado la barrera epitelial, las bacterias se multiplican y se establecen en los tejidos para alcanzar el número suficiente que les permita iniciar la infección. Deben obtener del organismo los elementos nutritivos necesarios para su crecimiento y reproducción, evitando los mecanismos de defensa del huésped.
Para la aparición de una infección o enfermedad infecciosa, ademas de la multiplicación de las bacterias en el organismo, es muy importante su rapidez o velocidad decrecimiento, ya que se puede producir la enfermedad antes de que el huésped haya podido desarrollar una respuesta inmune eficaz.

6.5. INVASiÓN

6.5.1. Factores que intervienen en las defensas del huésped

La respuesta humoral puede ser desencadenada por algunos factores de la bacteria, como el lipopolisacaridos o el péptidoglicano (activan el complemento), pero otros factores como la capsula, capas mucosas o Antígenos superficiales protegen a la bacteria. La resistencia a las sustancias bactericidas del suero se relaciona con el antígeno O y las proteínas de la membrana externa. Ante las defensas celulares, las bacterias secretan sustancias que impiden la fagocitosis en cualquiera de sus etapas; en la fase de adherencia, la presencia de capsula u otros componentes de la pared celular (sustancias mucosas, proteínas) pueden presentar acción antifagocitaria. Los factores que facilitan la agregación bacte:' riana impiden su fijación a los receptores del fagocito. También toxinas y enzimas (coagulasa) dificultan esta etapa. Algunas bacterias que son fag'ocitadas pueden resistir la digestión celular y multiplicarse intracelularmente.


6.5.2. Factores que favorecen la invasión

1. Hialuronidasas: facilitan la difusión de las células en los tejidos al destruir el cemento intercelular (acido hialurónico).
2. Coagulasas: transforman el fibrinógeno en fibrina.

3. Quinasas: sustancia que activa alguna proteína del suero que inhiba la coagulación del plasma y descomponga los coagulos de fibrina (plasmina o fibrinolisina).
4. Lipasas que alteran las membranas de las células.

6.5.3. Patogenia; vías de difusión

1. Contigüidad: en las zonas húmedas de la piel, mucosas, vías respiratorias
superiores.
2. Vía linfatica:primero a ganglios regionales y luego a sangre.
3. Vía sanguínea: bacteriemia. Vía mas rapida de difusión.
4. Vía nerviosa: sobre todo de difusión de toxinas.

6.6. CAPACIDAD LESIONAL

Alteraciones celulares y tisulares responsables del cuadro patológico.

6.6.1. Acción tóxica

Exotoxinas y endotoxinas. Las exotoxinas son sustancias solubles y difusibles que se sintetizan durante la fase de desarrollo y son liberadas al exterior, mientras que las endotoxinas estan ligadas a determinadas estructuras bacterianas y se consideran como compuestos tóxicos preformados, que se liberan por lisis de la bacteria.

* Exotoxinas: toxicidad elevada. El cuadro clínico depende tanto de la difusión de la toxina en el organismo como de su fijación específica a las células o tejidos susceptibles. Son labiles a la acción del calor, formol, pH, etc., y tienen un poder inmunógeno elevado. Se clasifican en:
a) Toxinas de acción general: -Toxina diftérica.
- Toxina de Bacillus anthracis.
- Neurotoxinas:
- Toxina tetanica.
- Toxina botulínica.
e) Enterotoxinas:
- Toxina colérica.
- Enterotoxinas de E. Coli.
- Enterotoxinas estafilocócicas.
- Enterotoxina termoestable de E. Coli.
- Enterotoxina de Bacillus cereus.
- Enterotoxina de Clostridium perfringens.
- Enterotoxina de Shigella.
- Enterotoxina de Clostridium difficile.
d) Toxina de Bordetella pertussis.
e) Exfoliatina de Staphilococccus aureus:
f) Toxinas que alteran la membrana:
- Toxina de Clostridum prefringens.
- Toxinas hemolíticas.
* Endotoxinas: se liberan por lisis y forman parte de los lipopolisacaridos.
Su toxicidad es menor que las exotoxinas y la acción es masinespecífica. Sus manifestaciones mas importantes son: fiebre, leucopenia yalteraciones vasculares. La patogenia de la endotoxina consiste en activar los sistemas de proteínas plasmaticas, en especial los sistemas del complemento, de la coagulación fibrinolisis y quininas.

6.6.2. Mecanismo inflamatorio

Las bacterias liberan sustancias (directamente o a través del sistema inmunológico) que son capaces de poner en marcha el proceso inflamatorio, responsable de muchos de los síntomas que se presentan en el cuadro patológico.

6.6.3. Mecanismo inmunológico

1. Reacción anafilactica: debida a la reacción Ag-Ac en la superficie de células cebadas, con liberación de sustancias vasoactivas responsables de los fenómenos patológicos (shock, broncoespasmo).
2. Reacción citotóxica: por Ac circulantes que se combinan con células del propio organismo, produciendo su lisis.
3. Reacción por complejos inmunes: irritación sobre los vasos y los tejidos.
4. Reacción mediada por células: acción de los linfocitos T que produce inflamación y formación de granulomas.

6.7. MODELOS DE INFECCiÓN

1. INFECCIONES PREDOMINANTEMENTE TÓXICAS: bacterias sin capacidad de invasión que secreta n exotoxinas causantes de la enfermedad (infecciones hipertóxicas).
2. INFECCIONES PREDOMINANTEMENTE INVASIVAS: cuando la acción patógena se considera debida a la capacidad de invasión de la bacteria sobre los tejidos.
3. INFECCIONES POR ACCiÓN COMBINADA: Intervienen factores invasivos y lesionales.

FISIOLOGíA BACTERIANA:
FUNCIONES DE RELACiÓN


1. Introducción
2. Funciones de relación
2.1. Modelos de relación huésped-bacteria 2.2. Infección: poder patógeno y virulencia
2.3. Factoresdeterminantes de la acción patógena
3. Requerimientos nutricionales de las bacterias
4. Condiciones físicas requeridas para el crecimiento
5. División y crecimiento bacteriano
6. Tipificación bioquímica: requerimientos nutricionales
Objetivos específicos
o Hacer posible el crecimiento de bacterias en el laboratorio a partir de un cultivo puro.
* Conocer las formas de relación huésped-bacteria
* Identificar los factores determinantes de la acción patógena de las bacterias.
o Ser capaz de preparar las condiciones requeridas para el crecimiento de las bacterias en el laboratorio, tanto físicas como químicas.
o Conseguir hacer crecer distintas colonias bacterianas en su medio apropiado.
o Familiarizarse con las técnicas de cultivos bacterianos.

1. INTRODUCIÓN

Las bacterias deben ser aisladas en un cultivo puro para que sea posible estudiarlas en el laboratorio. Para ello debe tenerse en cuenta sus diferentes requerimientos nutricionales y las condiciones físicas que permitan su crecimiento óptimo.

Para tipificar las bacterias bioquímicamente, se estudia una serie de características que se comparan con los caracteres medios de un grupo de microorganismos conocidos, la identificación sera mejor cuantos mas caracteres se estudien.

En esta unidad didactica se estudian los requerimientos nutricionales por los que se identifican ciertos grupos de bacterias.

2. FUNCIONES DE RELACIÓN

2.1. MODELOS DE RELACiÓN HUÉSPED-BACTERIA

al Saprófitos: viven libres en la naturaleza y se nutren de materia inorganica u organica no viva.

b) Simbiontes o parasitos: viven en la superfície o en el interior de un ser vivo, del que obtienen protección y las condiciones nutritivas necesariaspara su desarrollo y multiplicación. Presentan diversos grados:

* Comensalismo: la asociación es indiferente para el huésped. Pertenecen a este grupo la mayor parte de la flora normal de la piel y mucosas.

* Mutualismo: la asociación es beneficiosa para el huésped, como algunas bacterias del tracto gastrointestinal que sintetizan vitaminas, K, 82, 86,

* Parasitismo: la asociación es perjudicial para el huésped, que pone en marcha mecanismos de defensa como resultado de la aparición de una enfermedad infecciosa.

2.2.INFECCIÓN¡ PODER PATÓGENO Y VIRULENCIA

Infección: se puede definir como la entrada, establecimiento y multiplicación de bacterias en la superfície o en el interior de un huésped. Tiene diversos grados:

* Colonización: grado mínimo de relación, que comprende el establecimiento de bacterias en la piel o mucosas del huésped y se multiplica de forma suficiente para mantener su número, sin que exista respuesta inmunológi-
ca del huésped.

* Infección inaparente: cuando el establecimiento del parasito no va seguido de manifestaciones clínicas, pero existen pruebas de respuesta organica específica, demostrables por pruebas serológicas .
* Enfermedad infecciosa: el establecimiento del parasito provoca alteraciones mas o menos graves en el huésped, que se manifiestan por una serie de signos y síntomas clínicos.

Especificidad y postulados de Koch: Una propiedad de la infección es la especifidad. Cada microorganismo patógeno produce una infección determinada, dando al cuadro clínico un caracter especial.

Los postulados de Koch señalan las condiciones que se deben exigir a un microorganismo para considerarlo como el agente causal de una infección determinada:
1. El microorganismo debeencontrarse en todos los casos de la enfermedad.
2. Debe poder aislarse y obtenerse en cultivo puro a través de las lesiones.
3. Debe reproducir la enfermedad cuando se inocula, a partir de un cultivo puro, a un animal de experimentación susceptible.
4. Debe aislarse el mismo microorganismo puro a partir de las lesiones producidas en el animal.

2.3. FACTORES DETERMINANTES DE LA ACCIÓN PATÓGENA

Poder patógeno o patogeneidad: se puede definir como la capacidad que poseen los microorganismos para producir una enfermedad. Se refiere a una especie microbiana y permite compararla con las demas.
Virulencia: indica el mayor o menor grado de patogeneidad entre las cepas de una misma especie.

La patogeneidad y la virulencia no dependen exclusivamente del microorganismo, sino también de las características del huésped y de su grado de resistencia organica. Al depender la enfermedad de estos dos factores, se expresa con la siguiente fórmula:
Enfermedad = Número x virulencia / resistencia

Variaciones de la virulencia: en una cepa no es un caracter estable la virulencia, sino que puede variar como consecuencia de la aparición de mutaciones en el transcurso de su desarrollo:
* Puede aumentar por pases en animales susceptibles, que seleccionan las mutaciones mas adaptadas a la invasión del animal.
* Se puede variar por resiembras periódicas en medios de cultivo, que favorecen la selección de mutantes mejor adaptadas al nuevo medio, con la que disminuye la virulencia (vacunas).

Medida de la virulencia: determinada por la dosis mínima necesaria para producir un efecto patológico. En la inoculación a un lote numeroso de animales de la misma especie, se establece la dosis letal mínima que mata a un 50%(DL50), o la dosis mínima que produce infección (DI50).

Microorganismos patógenos y oportunistas: se consideran patógenos en función de su capacidad de producir enfermedad.

* Patógenos verdaderos o estrictos: tienen la propiedad de colonizar y producir una enfermedad en huéspedes considerados normales. Se caracterizan por:

- Procede de una fuente exógena, transmitidos por contagio con otros enfermos.

- Su acción patógena se debe en gran parte a factores dependientes del propio microorganismo (toxinas).

- Producir enfermedades infecciosas que se manifiestan por un cuadro clínico típico específico del agente causal.

* Patógenos potenciales u oportunistas: capaces de colonizar el organismo y producir enfermedad sólo cuando se produce un aumento de la susceptibilidad del huésped (inmunodeficiencias). Se caracterizan por:

- Proceder normalmente de una fuente endógena, y sólo producen la enfermedad después de un período de integración en la flora normal del enfermo.
- Su acción patógena se debe a las condiciones deficitarias del huésped.
- Producir un cuadro clínico atípico sobreañadido al estado que presenta
el enfermo.

Parasitos intracelulares y extracelulares: Las bacterias patógenas en relación con las células pueden actuar como parasitos extracelulares, intracelulares facultativos o intracelulares estrictos.

* Las bacterias extra celulares se multiplican en los espacios intercelulares y son sensibles a la fagocitosis. Sólo producen infección si elaboran sustancias o mecanismos que inhiban la fagocitosis.

* Las bacterias intracelulares facultativas: se reproducen en el espacio intercelular y si se produce la fagocitosis presentan mecanismos que interfieren en losprocesos de digestión celular y pueden permanecer viables en el interior del fagocito.

* Las bacterías intracelulares obligadas sólo pueden multiplicarse en el interior de las células.

3. REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES

Las bacterias necesitan para crecer ciertas condiciones físicas y químicas.

a) Como fuente de energía pueden utilizar la energía radiante de la luz y se designan como fotótrofas; otras requieren la oxidación de compuestos químicos (pérdida de electrones de un atomo) y en este caso se denominan quimiótrofas.

b) Las bacterias requieren una fuente de carbono. Como fuente de carbono, utilizan el dióxido de carbono. Unas bacterias lo utilizan como tal, denominandose autótrofas, otras requieren como fuente de carbono compuestos organicos y se llaman heterótrofas.

c) Las bacterias requieren nitrógeno; unas utilizan el nitrógeno atmosférico, otras compuestos inorganicos de nitrógeno, como nitrato potasico, y otras utilizan el nitrógeno procedente de compuestos organicos nitrogenados, como proteínas, péptidos, aminoacidos.

d) El azufre lo utilizan las bacterias, algunas como azufre elemental, mientras que otras necesitan compuestos organicos de azufre.
e) El fósforo lo utilizan en forma de fosfatos como sales del acido fosfórico.

f) Las necesidades de elementos metalicos como calcio, sodio, potasio, magnesio, manganeso, hierro, zinc, cobre y cobalto, se miden en partes por millón (ppm). Las bacterias los requieren en muy pequeñas cantidades.

g) Todas las bacterias requieren vitaminas para realizar sus procesos metabólicos normales. Algunas bacterias son capaces de sintetizar sus requerimientos totales de vitaminas a partir de otros compuestos del medio, otras no creceran si no se lesproporciona en el medio una o mas vitaminas ya preformadas.

Las vitaminas son compuestos organicos específicos necesarios para el crecimiento; éstas actúan en la formación de sustancias que activan las enzimas, que a su vez son sustancias que activan reacciones químicas.
h) Las bacterias requieren para el crecimiento que todos los nutrientes estén
en solución, por ello necesitan agua. .
i) Las bacterias según su capacidad de síntesis se dividen en:

Autótrofas, cuando ellas mismas sintetizan todos los nutrientes que necesitan; autótrofas estrictas, cuando sintetizan todo a partir de sustancias mínimas; o facultativas (con otras bacterias).

* Heterótrofas: protótrofas (sintetizan componentes esenciales) o autótrofas (utilizan factores de crecimiento).

j) Existe una gran variedad de tipos nutricionales entre las bacterias, y por ello existe una gran variedad de medios de cultivo diferentes para su crecimiento.

Medios de cultivo: Se define como medio de cultivo, el conjunto de nutrientes con determinadas condiciones ambientales que permiten que los microorganismos crezcan y se reproduzcan. Aporta la fuente de carbono, nitrógeno, elementos minerales, factores de crecimiento, agua y pH adecuado.

Los medios de cultivo son necesarios para conocer la bacteria infectante, para hallar muestras de flora saprófita (bacterias infectantes) y para conocer bacterias con necesidades especiales.
Tipos de medios:
* Sólidos o líquidos: agar-agar.
* Comunes-enriquecidos: agar-sangre de carnero.

* De enriquecimiento: medio líquido que permite la proliferación rapida de patógenos y las bacterias 'no patógenas' no crecen: medio de selenito (recupera las bacterias de las heces).
* Específicos: determinados parauna bacteria.
* Diferenciales: resaltan una cualidad de la bacteria, como los indicadores
de pH.
* De transporte.
* De conservación.
* En células vivas.
* Selectivos: sólidos, utilizan pH, presión osmótica, antisépticos.

4. CONDICIONES FíSICAS REQUERIDAS PARA EL CRECIMIENTO

Las bacterias necesitan condiciones físicas propicias para el crecimiento, así como los nutrientes adecuados. La gran variedad de tipos de bacterias hace necesario combinar medios adecuados y ambiente físico idóneo.
a) Temperatura:

La temperatura afecta a la tasa de crecimiento de las bacterias, a la cantidad total de crecimiento y a ciertos procesos metabólicos, así como a la morfología.

Se llaman bacterias psicrófilas las que crecen de O D a 30 DC (32 a 86 DF); mesófilas las que crecen de 25 D a 40 DC (77 a 104 DF) Y termófilas las que crecen a 50 DC o mas.

La temperatura óptima de crecimiento es la que permite el crecimiento en un periodo mas corto que el normal, que es de 12 a 24 horas.
b) Atmósfera gaseosa:

Las bacterias tienen una gran variedad de utilización del oxígeno libre. Se llaman aerobias aquellas que requieren oxígeno; anaerobias las que crecen en ausencia de oxígeno molecular; anaerobias facultativas las que crecen en presencia o en ausencia de oxígeno y microaerófilas las que crecen mejor en cantidades pequeñas de oxígeno.

c) Acidez o alcalinidad pH:

El pH óptimo de la mayoría de las bacterias es de 6,5 a 7,5. Los valores extremos de pH estan entre 4 y 9.

Para evitar los cambios de pH que se puede ocasionar en un medio debido a los productos producidos durante el crecimiento se utiliza un amortiguador de pH llamado buffer; éste, al ser incorporado al medio de cultivo, evitavariaciones de pH. Los buffer son combinaciones de sales tipo fosfato.
d) La luz es la fuente de energía de algunas bacterias:

d) La presión osmótica (la tensión que se ejerce cuando el agua difunde a través de una membrana) y la presión hidrostatica (tensión del líquido).

La bacteria esta sometida a los fenómenos osmóticos. La exposición de la bacteria a altas concentraciones salinas puede producir plasmolisis, existen bacterias marinas que resisten altas concentraciones de cloruro sódico y mueren fuera del mar al variar esa presión osmótica; estas bacterias se llaman halófilas. Las bacterias que pueden crecer en concentraciones de cloruro sódico y que también pueden crecer sin cloruro sódico en el medio se llaman halófílas facu /tativas.



f) Influencia de las radiaciones:

La luz y otras radiaciones influyen sobre los cultivos, favoreciendo o impidiendo el crecimiento. La oscuridad favorece el crecimiento, mientras que los rayos ultravioleta del solo de las lamparas de mercurio destruyen los microorganismos, al igual que las radiaciones ionizantes.

Los microorganismos que necesitan muchos factores de crecimiento se denominan exigentes, como el Lactobacílus. Estos microorganismos se utilizan a veces en ensayos para determinar la concentración de una vitamina en un medio.

Las vitaminas y otros factores organicos de crecimiento se encuentran en los extractos de carne o de levadura. Las vitaminas hidrosolubles y minerales de las carnes y levaduras se disuelven en el agua de extracción, que se evapora después para concentrar estos factores. Los extractos de levadura son particularmente ricos en vitaminas del grupo B. Si este tipo de medio esta en forma líquida, se denomina caldo de cultivo. Cuando se añade Agarse llama Agar nutritivo. El agar por sí mismo no es un nutriente.

5. DIVISIÓN Y CRECIMIENTO BACTERIANO

Las bacterias se reproducen por fisión binaria transversal.

* Duplicación del DNA: la división bacteriana se inicia con la duplicación del DNA. Simultaneamente, a partir de la zona central de la parte bacteriana se forma un septo transverso.

* Durante ambos procesos, los mesosomas se complejizan, y cada uno de ellos separa los dos replicados del cromosoma de forma que se integran en una célula hija.

* La separación de las dos células hijas tiene lugar una vez que se ha formado el tabique, por la acción de diversas enzímaslocalizadas en la zona próxima al septo, que hidrolizan las uniones en la capa del péptidoglicano.

Entre las causas inhibidoras de la replicación estan las radiaciones UVA, los antibióticos, defectos nutricionales y mutaciones. Estos factores inhiben la formación del septo.
Crecimiento bacteriano:

Sobre una población bacteriana se sigue un estudio cuantitativo, valorandose por métodos directos o indirectos.

Los métodos directos permiten una estimación aproximada del número de bacterias. Los contadores electrónicos detectan gracias a un par de electrones el paso de una partícula, pero no diferencian entre células viables y no viables; cuentan el total.

Los métodos indirectos se emplean para determinar las masas celulares. Los métodos turbidimétricos son los mas utilizados.
Curva de crecímíento bacteríano:

El crecimiento de las bacterias sobre un medio líquido es exponencial, y la determinación cuantitativa se puede representar en una curva en la que se distinguen las siguientes fases o períodos:

* Fase de latenGÍa: se define como el tiempo necesario para laadaptación de las bacterias al medio donde se siembran. Aumentan de volumen, pero no se dividen.

* Fase de desarrollo exponencial o logarítmica: en esta fase, las bacterias se multiplican a velocidad constante y exponencial, la actividad metabólica es maxima y la sensibilidad a los agentes físicos, químicos, agentes antimicrobianos y fagos es óptima en esta fase.

* Fase estacionaria: en esta fase el número de células que nacen es igual al que mueren.

* Fase de declinación o muerte: en esta fase las condiciones del medio se vuelven adversas y las bacterias mueren.



Diauxia

Se llama así la doble curva que tiene lugar cuando se cultivan microorganismas en presencia de dos sustratos, por ejemplo, glucosa y xilosa.

Primero la curva corresponde al desdoblamiento de la glucosa por las enzimas constitutivas, y tras una nueva fase de latencia se inicia el desdoblamiento de la xilosa, que corresponde a la otra parte de la curva de crecimiento





































Fig. 3.1. Curva de crecimiento bacteríano hipotética, obtenida al admitir que se inocula una sola célula en un medio y que tienen lugar divisiones de forma regular a intervalos de 30 minutos. La línea discontinua indica el logaritmo del número de bacterias frente al tiempo y la línea continua muestra el número de bacterias frente al tiempo













































Fig. 3.1.1. Curva de crecimiento bacteríano. ,. Fase de latencia en la que no hay aumento de población, las células sufren cambios en su composición química y aumentan de tamaño, aumento de sustancias intracelulares. 2. Fase logarítmica o exponencial en la que las células seduplican al mismo ritmo. Actividades metabólicas constantes, condición de crecimiento equilibrado. 3. Fase estacionaria en la que se van agotando los nutríentes y acumulando productos tóxicos, en la que algunas células mueren y otras crecen y se dividen. El número de células viables se mantiene constante o baja. 4. Fase de muerte o lisis en la que mueren mas células que las que se producen. La tasa de muerte se acelera, haciéndose exponencial. Las células mueren todas en cuestión de horas o días dependiendo de la especie.

6. TIPIFICACIÓN BIOQuíMICA: REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES

Los microorganismos mas exigentes requieren para su crecimiento ciertas sustancias específicas llamadas factores de crecimiento, entre ellos destacan las vitaminas, aminoacidos y factores de la coagulación.

Ejemplo de estos requerimientos lo tenemos en la necesidad que tiene el género Haemophilus de factor X o hemina o/y factor V o NAD para desarrollarse óptimamente.
Fundamento:
Investigar el requerimiento de los factores V y X de las bacterias.

Se obseva el crecimiento de las colonias alrededor de las tiras de papel de filtro impregnadas de factor V y X en un medio deficitario de estos factores.
Los factores X y V son hidrosolubles y difunden rapidamente en un medio
sólido como el agar.
Material:
* Placa de Petri.
* Pipeta Pasteur.
* Pipeta calibrada.
* Asa.
* Tubos estériles.
Reactivos:

* Microorganismo.
* Caldo infusión cerebro-corazón.
* Dos tiras de papel de filtro impregnadas con factor X una y con factor V la otra.
* Medio deficiente en factor X y V:
- Agar Mueller-Hinton.
- Agar tripticasa soja.
Técnica:

a. Realizar una suspensión con 2-3 mi de caldo infusión cerebro-corazóny un cultivo puro de microorganismo problema.

b. En una placa con agar Mueller-Hinton realizar una siembra con esta suspensión; se puede utilizar el método de superfície de Kirby-Bauer o el de inundación.

c. Se coloca una tira impregnada con el factor X y otra con el factor V en la superficie del agar separadas un centímetro, y se presionan ligeramente.
d. Se incuba la placa durante 18-24 horas a37 DC.



INTERPRETACiÓN DE LOS RESULTADOS:

Se observa el crecimiento de los microorganismos alrededor de las tiras reactivas.
El género Haemophílus ínfluenzae requiere el factor X y V para su crecimiento. Se debe recordar que el medio de cultivo empleado para el ensayo de requerimientos nutricionales debe carecer del factor de crecimiento a estudiar. Para el estudio de requerimientos de otros factores de crecimiento se emplea la misma técnica descrita, ejemplo, riboflavina, tiamina etc. Y se pueden emplear en vez de tiras reactivas discos impregnados.



A)


B)



C)

Fig. 3.2. Requerimientos nutriciona/es para factor Vy factor X. A) Requiere factor X, B) requiere factor V, C) requiere ambos factores.

CLASIFICACiÓN Y NOMENCLATURA DE LAS BACTERIAS


1. Introducción
2. Sistema de clasificación universalmente aceptado para las bacterias.
Bergey' s Manual of Determinative Bacteriology.

Objetivos específicos

• Dotar al alumno de los conocimientos basicos que le permitan introducirse y utilizar un sistema de clasificación bacteriológica universalmente aceptado .

• Sensibilizar al alumno de la importancia de la clasificación y nomenclatura bacteriana para su posterior identificación.

. INTRODUCCIÓN

Engeneral, las formas de vida pertenecen a dos reinos: el animal y el vegetal. Sin embargo, existen forma,s muy sencillas de vida que no son faciles de clasificar taxonómicamente. Este sería el caso de los microorganismos. Algunos de ellos presentan caracteres del reino animal, como su capacidad de movimiento, producción de energía, etc, mientras que otros microorganismos se asocian a vegetales, porque presentan clorofila y obtienen energía a partir de la luz por fotosíntesis, tal y como lo hacen las plantas verdes. Precisamente, por estas similitudes y diferencias con ambos reinos, ha sido necesario adoptar decisiones arbitrarias que han permitido poder clasificar taxonómicamente los microorganismos.

Todo comenzó con Darwin, en 1859, cuando consideró a los microorganismos como seres vivientes que no tenían porque pertenecer claramente a uno u otro grupo. Posteriormente Haeckel, en 1866, fue mas alla, y habló de un tercer reino denominado protista que incluía seres vivos con características animales y vegetales y cuya organización era demasiado sencilla. A partir de aquí, y según el grado de complejidad de sus estructuras celulares, los protistas se dividieron en:

1. Protistas superiores, que corresponden a hongos, protozoos y casi todas las algas que poseen células eucariotas (núcleo verdadero) semejantes a plantas o animales y englobados en estos reinos.

2. Los protistas inferiores, que incluyen las bacterias y el grupo de algas cianofíceas, que se caracterizan por ser células menores o procariotas (no presentan membrana que separe el núcleo del resto de la célula).

Desde entonces se ha intentado crear un sistema de clasificación útil y universalmente aceptado para las bacterias. En la actualidad el sistema declasificación mas aceptado a nivel munidal es el Manual de Bergey (Bergey 's Manual of Determinative Bacteriology), cuya primera edición apareció en 1923 y la séptima en 1957. La elaboración de la octava y última edición hasta el momento ha tardado mas de diecisiete años en realizarse. Ésta ha permitido clasificar todas las bacterias hasta el momento encontradas en un total de 19 secciones subtituladas con nombres comunes de tipo descriptivo y afines, tal y como se indicara a continuación. Aquí van a ser expuestas las mas importantes hasta el momento encontradas aunque para mas detalle, sería conveniente la consulta de la octava edición de Bergey 's Manual of Determinative Bacteriology, (1974).

2. SISTEMA DE CLASIFICACIÓN UNIVERSALMENTE ACEPTADO PARA LAS BACTERIAS. BERGEY'S MANUAL OF DETERMINA TIVE BACTERIOLOGY

Las bacterias se encuentran clasificadas dentro del reino procariota, División 1, donde se incluye un total de 19 secciones.


Sección 1: incluye bacterias fototróficas, que en ningún caso son patógenas para el hombre. Presentan características vegetales, como el poder obtener energía a partir de la luz por procesos de fotosíntesis. En dicha sección se incluyen tres familias, cada una de las cuales presenta una gran cantidad de géneros.
* Familia Rodospiri/aceae
* Familia Cromatiaceae
* Familia C/orobiaceae
Sección 11: aquí se incluyen bacterias deslizantes, que hasta el momento no
se asocian a procesos patógenos:
* Familia Mixococaceae
* Familia Arcangiaceae
* Familia Cristobacteriaceae
* Familia Po/iangiaceae
* Familia Citofagaceae
* Familia Begiatoaceae
* Familia Acromatiaceae
* Familia Pe/onemataceae
Sección 11I: en dicha sección se incluye un total de 7 géneros de bacteriasenvainadas que hasta el momento, salvo alguna excepción, no se asocian a procesos patógenos para el hombre:
* Género Lieskeella
* Género C/onothrix
* Género Phragmidiothrix
* Género Crenothrix
* Género Leptothrix
* Género Streptothrix
* Género Sphaeroti/us
Sección IV: a dicha sección pertenece un total de 17 géneros distintos, que se caracterizan por incluir bacterias pedunculadas que se dividen por gemación. Hasta el momento no se han encontrado agentes patógenos para el hombre.
Sección V: en dicha sección nos vamos a encontrar el Orden Espiroqueta/es, con la Familia Espiroquetaceae, que engloba un total de 5 géneros. Aquí sí se encuentran muchas especies patógenas para el hombre
* Género Spirochaeta
* Género Treponema
* Género Borre/ia
* Género Leptospira
* Género Cristispira


Ejemplo de especies patógenas para el hombre: Treponema pallidum (sífilis), Borrelia recurrentis (fiebres recurrentes). (Véase unidad didactica 11).

Sección VI: en dicha sección se encuentran las bacterias curvadas o espiraladas e incluye la Familia Espiralaceae con los géneros Spirilum y Campylobacter, alguna de cuyas especies se asocia a procesos patógenos del hombre. Ademas, dentro de dicha sección, existe un total de 4 géneros de afiliación dudosa, no asociados a procesos infecciosos en el hombre.

Sección VII: en esta sección se incluyen bacilos y cocos aerobios Gram-. Se va a dividir en un total de 5 familias y 6 géneros de afiliación dudosa. Las familias de esta sección son:

* Familia Pseudomonadaceae, que engloba un total de 4 géneros, siendo desde un punto de vista clínico el Género Pseudomonas el mas importante para el hombre. (Véase unidad didactica 7).

* Familia Azotobacteriaceae, con untotal de 4 géneros, que hasta el momento no presentan importancia clínica para el hombre.
* Familia Rizobiaceae, que incluye 2 géneros

* Familia Metilomonadaceae, que incluye igualmente otros 2 géneros sin importancia clínica para el hombre.
* Familia Halobacteriaceae, que incluye 2 géneros
Los 6 géneros de afiliación dudosa hasta el momento encontrados son los
siguientes: (Véase unidad didactica 7).
* Género Alcaligenes
* Género Acetobacter
* Género Brucella
* Género Bordetella
* Género Francisella
* Género Thermus

En los géneros de afiliación dudosa sí nos encontramos con especies con gran importancia clínica para el hombre, como el Género Brucella, agente etiológico de las brucelosis o fiebres de malta en el hombre, o algunas especies del Género Bordetella, como B. pertussis, responsable de la tosferina.
Sección VIII: en esta sección se encuentran los bacilos Gram- anerobios facul-
tativos. Esta formada por dos importantes familias: (Véase unidad didactica 6).
* Familia Enterobacteriaceae
* Familia Vibrionaceae
La Familia Enterobacteriaceae esta formada por un total de 12 géneros:
* Género Eschericchia
* Género Sa/monel/a
* Género Shige//a
* Género Enterobacter
* Género Citrobacter
* Género K/ebsie//a
* Género S erra tia
* Género Proteus
* Género Yersinia
* Género Edwardsie//a
* Género Hafnia
* Género Erwinia
En su mayoría, estos géneros presentan especies patógenas para el hombre, por ejemplo Sa/mone//a typhi (fiebres tifoideas), Shige//a disenteriae (disentería bacilar), Yersinia pestis (peste), etc.
La familia Vibrionaceae se caracteriza por presentar forma de coma o bacilo
incurvado. Incluye un total de 5 géneros:
* Género Vibrio
*Género Aeromonas
* Género P/eisomonas
* Género Photobacterium
* Género Lucibacterium
De todos estos géneros, el Vibrio es el que presenta las especies mas patógenas para el hombre, como por ejemplo la especie Vibrio cho/erae, agente etiológico del cólera.
Ademas, en la sección VIII se incluye aproximadamente un total de 9 géneros de afiliación hasta el momento dudosa. Dentro de estos géneros se encuentran especies con interés clínico para el hombre, como es el caso del Género Haemophy/us con la especie H. inf/uence, responsable de algunas meningitis en niños o algunas especies del Género Pasteure//a o F/avobacterium, donde se han descrito casos de meningitis en lactantes y prematuros. (Véase unidad didactica 7).
Sección IX: esta sección la forman bacterias anaerobias Gram-. Se incluye la Familia Bacteroidaceae con un total de 3 géneros y que, junto a 6 géneros de dudosa afiliación, presenta poco interés clínico para el hombre.
Sección X: en esta sección se encuentran cocos y cocobacilos Gram- y aerobios. Se incluye la Familia Neiseriaceae con los géneros Neisseria, Branhame//a, Moraxe//a y Acinetobacter, con importancia clínica para el hombre en alguna de sus especies como por ejemplo N. meningitidis (meningitis) y N. gonorroheae (gonorrea). La sección X también incluye dos géneros de dudosa afiliación y sin importancia clínica para el hombre. (Véase unidad didactica 5).
Sección XI: en esta sección se encuentran cocos anaerobios Gram-. Se incluye la Familia Vei/one/aceae, que engloba un total de 3 géneros sin interés clínico hasta el momento para el hombre.

Sección XII: en esta sección se encuentran las bacterias quimiolitótrofas Gram-. Incluye las siguientes familias:

* Familia Nitrobacteriaceae.Sus especies utilizaran el amoniaco, los nitratos o nitritos (según la especie que sea) para formar nitrógeno atmosférico. En esta Familia aparece un total de 7 géneros, siendo uno de los mas importantes el Género Nitrobacter. Hasta el momento no se han descrito casos de efectos patógenos para el hombre.

* Familia Siderocapsaceae, que incluye un total de 4 géneros que tienen en común el utilizar sales de hierro en su metabolismo. No se han encontrado especies patógenas para el hombre.
En esta sección también se incluye una serie de géneros de afiliación dudosa y no patógenos para el hombre capaces de meta balizar ciertos compuestos azufrados, como por ejemplo Thiobacillus, Sulfolobus, etc.
Sección XIII: aquí se incluyen bacterias productoras de metano. Incluye la Familia Metanobacteriaceae, con un total de 3 géneros sin interés clínico para el hombre.

Sección XIV: en esta sección se encuentran bacterias en forma de coco y Gram+. Incluye un total de 3 familias: (Véase unidad didactica 5).

* Familia Micrococaceae, con 3 géneros: Género Micrococcus, Género Staphylococcus y Género Planococcus. Alguno de éstos presenta gran interés clínico para el hombre, como S. aureus.

* Familia Streptococaceae, con un total de 5 géneros, siendo el Género Streptococcus el mas importante de todos ellos debido al efecto patógeno para el hombre de alguna de sus especies, como por ejemplo, S. pyogenes.
* Familia Peptococaceae. Son anaerobios estrictos y presentan un total de 4 géneros. Salvo alguna excepción, no se han descrito cuadros clínicos.
Sección XV: en esta sección se encuentran las bacterias bacilares y coco ideas formadoras de endosporas. Incluye la Familia Bacilaceae, con un total de 5 géneros: (Véase unidad didactica10).
* Género Bacillus
* Género Clostridium
* Género Sporolactobacillus
* Género Desulfatomaculum
* Género Sporosarcina
De todos estos géneros los mas importantes desde un punto de vista clínico son el Género Bacillus [p.e. B. antrhacis (antrax o carbunco)] y el Género Clostridium [p.e., CI. tetani (tétanos)] y CI. botulinum (botulismo), etc.
Sección XVI: aquí se encuentran las bacterias bacilares Gram- no formadoras de esporas. Incluye la Familia Lactobacilaceae con el Género Lactobacillus, que tiene interés en la industria alimenticia y un total de 3 géneros de dudosa afiliación: (Véase unidad didactica 8 y 10).


* Género Listería
* Género Erysípelothríx
* Género Caryophanon
Los dos primeros géneros presentan especies asociadas a algunos procesos patógenos en el hombre.
Sección XVII: en esta sección se encuentran los actinomices y otros microorganismos relacionados. Se incluyen el Orden Actínomícetales, con un total de 7 familias, y otros microorganismos relacionados con esta sección, tales como la Familia Propíoníbacteríaceae y el Género Corínebacteríum.
Orden Actínomícetales. Presenta las siguientes familias:
Familia Actínomícetaceae, con un total de 5 géneros de los que el mas importante desde un punto de vista clínico para el hombre es el Género Actínomyces.
* Familia Actínoplanaceae, con un total de 10 géneros sin interés clínico para el hombre.
* Familia Dermatofílaceae, con un total de 2 géneros.
* Familia Mícobacteríaceae, con el Género Mycobacteríum, que presenta gran importancia clínica por su efecto patógeno, p.ej.: Mycobacteríum tuberculosís (tuberculosis) y Mycobacteríum leprae (lepra). (Véase unidad didactica 9).
* Familia Nocardíaceae, con un total de 2géneros, Nocardía y Psedonocardía, asociada alguna de sus especies a procesos patógenos en el hombre. (Véase unidad didactica 9).
* Familia Streptomícetaceae. Son bacterias muy filamentosas, que incluyen un total de 4 géneros no patógenos para el hombre pero con gran interés para éste, p.e. Género Streptomyces. A partir de alguna de sus especies se obtiene la estreptomicina.
* Familia Mícromonosporaceae, con un total de 6 géneros no patógenos para el hombre
Otros microorganismos relacionados dentro de esta misma sección son, la Familia Propíoníbacteríaceae, con 2 géneros, Género Propíoníbacteríum y Géne'ro Eubacteríum. Se han descrito ciertos cuadros clínicos de importancia para el hombre, [p.e. P. agnes (infecciones en piel)]. Dentro de esta sección se encuentran ademas el Género Corynebacteríum con alguna especie patógena para el hombre, (p.e. Corynebacteríum díptheríoe. (Véase unidad didactica 8).
Sección XVIII: en esta sección se encuentran todas las Ríckettsías, que son bacterias que presentan ciertas similitudes con virus. En esta sección nos encontramos 2 importantes órdenes: Orden Ríckettsíales y Orden Clamídíales.
Orden Ríckettsíales. Incluye las siguientes familias:
* Familia Ríckettsíaceae. Esta formada por 10 géneros aproximadamente de los que, desde un punto de vista clínico para el hombre, los géneros Ríckettsía y Coxíe//a son los mas importantes.
* Familia Barto/enaceae, con 2 géneros importantes, Bartone//a y Grahame//a.
* Familia Anap/asmataceae, con un total de 5 géneros, no habiéndose descrito hasta el momento casos patógenos para el hombre.
Orden C/amídía/es. Incluye una sola familia:

* Familia Ch/amídíaceae, que presenta un solo género, el Género Ch/amydía, del que se han descrito procesospatógenos para el hombre en alguna de sus especies. (Véase unidad didactica 12).

Sección XIX: esta sección la forman micoplasmas, que son bacterias que se diferencian del resto porque no presentan pared bacteriana. Aquí se encuentra la Familia Mícop/asmaceae con el Género Mycop/asma, del que alguna de sus especies se ha asociado a ciertos procesos patógenos, y la Familia Aco/ep/asmataceae con un solo género no patógeno para el hombre


































































EXAMEN MICROSCÓPICO:
OBSERVACiÓN DE MICROORGANISMOS VIVOS




1. Introducción.
1. Nociones de microscopía. El microscopio óptico. 2.1. Amplificación.
2.2. Poder de resolución. 2.3. Iluminación.
2.4. TipoS de microscopía.
3. Examen en fresco de bacterias vivas. Gota pendiente. 3.1. Introducción.
3.2. Condiciones que debe cumplir una preparación para observar el microorganismo al microscopio.
3.3. Técnicas que permiten observar los microorganismos in vivo.
Objetivos específicos

• Utilizar los conocimientos basicos que permitan trabajar en condiciones de esterilidad.
* Saber manejar el microscopio óptico.
* Explicar en qué consiste un microscopio óptico y las características mas específicas de éste.

• Realizar un examen en freoco de bacterias vivas y comprobar si presentan o no movilidad.

• Describir las distintas técnicas que se pueden utilizar a la hora de hacer un examen en fresco.
1. INTRODUCCIÓN

En general, todas las bacterias en microbiología presentan una morfología y un tamaño muy variables, así como distintos sistemas deagrupación. El conocer este tipo de características propias de cada grupo bacteriano se consigue por medio de diferentes métodos de examen, ya sea por estudios en fresco, en cuyo caso se observan las bacterias vivas o por tinción, que nos permite una mayor visualización y contraste, pero se observan muertas.

En cualquier caso, sea cual fuere la técnica a realizar, siempre se necesitara para observar las bacterias la utilización del microscopio. Ahora bién, si lo que se pretende investigar en la bacteria, ademas de su morfología, es su movilidad, la técnica a utilizar sera aquella que permita observar al germen in vivo, es decir, en fresco ya que la mayor parte de las tinciones matan al microorganismo, lo que imposibilita observar su movilidad.

2. NOCIONES DE MICROSCOPÍA.
EL MICROSCOPIO ÓPTICO

La microbiología se ha podido desarrollar a partir de la aparición y progreso del microscopio, gracias al cual se pueden visualizar las bacterias.

En microscopía nos podemos encontrar un microscopio simple, que no es mas que una lente biconvexa o un microscopio compuesto, que emplea dos sistemas de lentes separadas, consiguiendo con ello mayores aumentos.

Existen actualmente muchos tipos de microscopios compuestos, pero todos ellos se basan en los mismos principios. Así pues, todo microscopio basicamente constara de:
* Un sistema óptico que aumenta la imagen.
* Un sistema de visualización que amplifica adecuadamente dicha imagen. De acuerdo con lo expuesto, para comprender el funcionamiento de tales
sistemas se hace necesario conocer los conceptos de amplificación, poder de resolución e iluminación.

2.1. AMPLIFICACiÓN

La amplificación de la imagen en un microscopio se obtiene mediante dos sistemas de lentes:* Un primer sistema de lentes situado mas cerca de la muestra, el objetivo que amplía la imagen real.

* El segundo sistema de lentes, que se sitúa mas alejado de la muestra y mas próxima alojo humano, es la lente ocular, que se encargara de ampliar esa imagen real originando una imagen virtual que es la que percibe el ojo humano.








































Fig. 14.1. Descripción de un microscopio

Los microscopios en casi todos los laboratorios suelen poseer tres objetivos:
* Un objetivo seco de pocos aumentos (16 mm).
* Un objetivo seco de muchos aumentos (4 mm).
* Un objetivo de inmersión (1/8 mm).

Los valores de 16/ 4 Y 1/8 mm indican la distancia focal de cada objeto. La amplificación total de un microscopio óptico se obtiene multiplicando la amplificación del objetivo/ que estara grabada en su cubierta, por la amplificación del ocular, que suele venir indicada en la parte superior de la lente ocular o en un lateral.
EXAMEN MICROSCÓPICO: OBSERVACIÓN DE MICROORGANlSMOS VIVOS



_________ ObTVO ~
[
,smm 14~.m:,.~m J 11~:,m'
~ ~ ~
0,13 mm . - 0,46 mm 5 mm Distancia de trabajo
::=========:::1 -, ----- • 1








Diafragma

Fig. 14.2. Distancia de trabajo. Apertura del diafragma.

Ademas existen dos ruedas o tornillos con los que se consigue un enfoque mas fino de la muestra:
* Un tornillo de enfoque grosero que permite un enfoque aproximado de la muestra.
* Un tornillo de enfoque fino, que logra un enfoque preciso final.

2.2. PODER DE RESOLUCiÓN

El poder de resolución de una lente es lacapacidad que ésta presenta para poder observar dos puntos adyacentes como distintos y separados.

El poder de resolución en un microscopio esta en función de la longitud de onda (A) de la luz empleada y de las características del sistema de lentes, llamada apertura numérica.

El poder de resolución equivale al diametro de la estructura visible mas pequeña y se expresa como:
PR (Poder de Resolución) = Longitud de onda / Apertura numérica




Es importante considerar que no es muy adecuado utilizar amplificaciones muy grandes debido a la pérdida de nitidez de las imagenes¡ ya que estan menos definidos los detalles¡ y las imagenes son siempre mas borrosas.

La apertura numérica (AN) es una medida de la apertura del objetivo y concretamente la mitad del angulo de apertura. Dicho valor se multiplica por el índice de refracción del medio que cubre el espacio entre el cubreobjetos¡ de tal forma que tendríamos:


AN = n . sen (o)
o = mitad del angulo del cono de luz que entra en el objetivo. Fig. 14.3.



, I I I I , ,
:
Lente objetivo


Muestra



Portaobjetos
'
'-
''
' '



Luz



Fig. 14.3. Amplificación mediante aceite de inmersión.



El valor maximo de apertura numérica es muy limitado¡ de tal forma que para un objeto seco es menos de O¡ 1 Y en los objetos de inmersión algo mas de 1 (1¡2 - 1A).


La longitud de onda de la luz utilizableen un microscopio óptico es también limitada¡ ya que el espectro de luz visible comprende de 400 nm a 700 nm.


Así pues¡ el valor de resolución de un microscopio estara restringido a los valores de apertura numérica (AN) y longitud de onda (A-). Es decir¡ el mejor poder de resolución que permita visualizar el objeto mas pequeño de forma nítida se obtendra con una longitud de onda de luz visible corta y un objetivo que tenga el valor maximo de apertura numérica.


Se utiliza aceite de inmersión porque así aumenta la amplificación numérica¡ mejorandose el poder de resolución (figura 14.3).


2.3. ILUMINACiÓN

La iluminación es esencial para aprovechar adecuadamente los aumentos y la resolución de un microscopio.

La luz procedera de la fuente de iluminación que se situara en la parte mas baja del microscopio. Dicha luz penetrara en el condensador y éste llegara al objetivo que lo amplificara, así pues debera llegar un cono de luz muy grande para que su amplificación sea mayor. Este tamaño del cono de luz que llega al objetivo se podra controlar con el diafragma situado inmediatamente debajo del dispositivo condensador.

Si, por ejemplo, el diafragma estuviera completamente abierto, se perdería contraste y nitidez.

Si utilizamos el objetivo de inmersión la distancia de trabajo es muy pequeña y/ en estos casos, hay que abrir mas el diafragma para facilitar una mayor amplificación que aumente el maximo poder de resolución (Figura 14.2).

2.4. TIPOS DE MICROSCopíA

Los microscopios se clasifican basicamente en dos grupos en función del
tipo de luz utilizada y amplificación. De acuerdo con esto tenemos:
* Microscopio de luz óptica
* Microscopio electrónico.

El microscopio mediante el cualla amplificación de la imagen se obtiene por un sistema de lentes ópticas, corresponde a los microscopios de luz y abarcan los siguientes tipos:
* Microscopio de campo luminoso
* Microscopio de campo oscuro
* Microscopio de luz ultravioleta
* Microscopio de fluorescencia
* Microscopio de contraste de fases

El microscopio mediante el cual la amplificación de la imagen se hace a través de un haz de electrones en lugar de ondas luminosas corresponde al microscopio electrónico.

En general, para el trabajo diario, el instrumento de uso mas común es el microscopio de campo luminoso o microscopio óptico. Los otros tipos son utilizados con fines especiales o trabajos de investigación,

A) Microscopía de campo luminoso (microscopio óptico). Esta basada en los mismos principios de amplificación, poder maximo de resolución e iluminación explicados en los apartados anteriores.

B) Microscopía de campo oscuro. Es un microscopio óptico donde aparecera un efecto producido por la técnica del campo oscuro, que consiste en un fondo negro sobre el cual se ven los objetos intensamente iluminados. Esto se obtiene al equipar al microscopio con un condensador especial que dirige la luz desde la fuente luminosa por una trayectoria tal que sólo los haces de luz que tropiezan con los objetos de la muestra se dirigen al objetivo.

C) Microscopía de luz ultravioleta. El microscopio de luz ultravioleta permite un poder de resolución mejor, ya que la luz ultravioleta tiene una longitud de onda de 180 a 400 nm frente a la de 400 a 700 nm del espectro visible. Lasimagenes del microscopio ultravioleta pueden ser visualizadas por el ojo humano gracias a un tubo convertidor de imagen que se registrara sobre un plano fotografico otelevisión sensible a la luz ultravioleta.

D) Microscopía de fluorescencia. Existen sustancias en la naturaleza que son capaces de absorber la energía de las ondas ultravioletas y emitirla como ondas visibles de mayor longitud de onda. De ahí que existan materiales que a la luz ordinaria presentan un color y a la luz ultravioleta otro distinto y mas intenso. Este tipo de materiales se denominan fluorescentes. Basandonos en esta propiedad, la microscopía de fluorescencia consistira en teñir previamente el microorganismo con un colorante fluorescente y observarlo al microscopio con luz ultravioleta. Estas técnicas tienen gran importancia en inmunología.

E) Microscopía de contraste de fases. La microscopía de contraste de fases es uno de los mejores métodos para la visualización de microorganismos vivos.




Fig. 14.4. Fotografía de Penicillium sp al microscopio óptico de contraste de fase (x400). Tinción lactofenol-Azul de algodón.

© Editorial Paraninfo/215
Las preparaciones de la muestra se iluminaran de manera controlada mediante objetivos especiales de contraste de fase de la luz¡ con lo cual se pueden distinguir índices de refracción similares. Es decir¡ establecer un contraste de fase hace diferenciar estructuras que tienen índices de refracción muy próximos¡ no pudiéndose distinguir dichas estructuras con el microscopio convencional.

Este tipo de rnicroscopía es mucho mas sensible a cualquier variación de la densidad de los componentes de la muestra¡ que seran desviados rapidamente al incidir la luz sobre ellos. Dichas desviaciones se corresponderan con los distintos índices de refracción¡ observandose en este tipo de microscopía una zona de mayorbrillantez que suele corresponder a los bordes del objeto que se esta observando.





EXAMEN MICROSCÓPICO:
TINCIONES



1. Introducción.
2. Factores que afectan a toda técnica de tinción.
1. Principales técnicas de coloración. 3.1. Colorantes.
3.2. Preparación de un frotis. 3.3. Técnica de tinciÓn.
4. Tinciones bacterianas. Tipos. 4.1. Tinciónsimple. 4.2. Tinción negativa.
4.3. Tinciones diferenciales. 4.4. Tinciones estructurales. 4.5. Tinciones especiales.

Objetivos específicos
• Identificar todo el material que se va a necesitar en una tinción . .• Desarrollar correctamente las distintas técnicas de tinción.

• Interpretar una tinción, el tipo al que pertenece y las características bacterianas que pueden conocerse a partir de las técnicas de tinción.
• Saber trabajar en condiciones de asepsia.

1. INTRODUCCIÓN

La morfología bacteriana puede ser estudiada de dos formas distintas:

1) Por visualización de los microorganismos vivos sin teñir, lo que nos permite ademas observar su posible movilidad.

2) Por visualización de los microorganismos teñidos mediante colorantes, con una concentración tal que hacen morir a la bacteria y no permiten observar su movilidad, pero sin embargo se mejora notablemente la visualización de su morfología y otras estructuras según el tipo de tinción llevada a cabo.

En general todas las bacterias vivas son practicamente incoloras, no presentando suficiente contraste con el medio acuoso donde se encuentran suspendidas, con lo cual no pueden ser observadas con claridad. Pero si se tiñen se produce un gran contraste con respecto al medio que las rodea. Ademas,alguno de estos colorantes puede también teñir estructuras internas de la bacteria, lo que nos sirve para su identificación.
Por todo esto, las principales ventajas de las técnicas de tinción son:
* Observar mas adecuadamente su morfología.

* Proporcionar el contraste preciso y suficiente en cada caso, lo que permitira diferenciar distintos tipos morfológicos.

* Establecer una información complementaria sobre sus estructuras internas y/o externas que no podrían ser observadas por examen en fresco.

* Conocer sus características tintoriales orientandonos hacia un grupo taxonómico u otro en la clasificación bacteriana.

2. FACTORES QUE AFECTAN A TODA TÉCNICA DE TlNCIÓN

En general, las técnicas de tinción son imprescindibles para el estudio microbiológico de las bacterias, constituyendo el primer paso en el examen bacteriológico que, para completarse y conducir a la identificación, precisa de otras técnicas complementarias de identificación como, por ejemplo, las pruebas bioquímicas.

Las técnicas: de coloración, como primer paso, constituyen una practica diaria en el laboratorio de microbiología, por lo que se debera considerar que son muchos los factores que pueden alterar los resultados obtenidos en toda técnica de tinción.
Así pues, los principales factores que pueden afectar a una tinción son:

* Pureza del colorante. A mayor grado de impurezas, mayor error, y menor calidad en la tinción.

3.1. ESTUDIO DE SU FORMA

Con respecto a la forma que va a a presentar esa bacteria como organismo individual se ha de considerar que las bacterias suelen adoptar fundamentalmente alguna de las formas siguientes:
* Oval o esférica.
* Cilíndrica o en forma de bastón.