Universidad Católica
De la Santísima
Concepción

Facultad de Educación

INFORME DE LABORATORIO Ns1
“METODOS USADOS EN LA BIOQUÍMICA: ESPECTROFOTOMETRIA”
INTRODUCCIÓN
El ojo humano responde a la radiación electromagnética en un intervalo de longitudes de onda entre 400-750 nm (es decir, el 'espectro visible'). Muestras de la luz que contienen un espectro continuo de todas las longitudes de onda entre 400-750 nm será percibido por el cerebro como “Luz Blanca” (por ejemplo el sol). (Glenn , 1967)
A menudo los objetos aparecen de color debido a su absorción selectiva de la luz dentro de las regiones del espectro visible. (Glenn, 1967)
El Espectrofotometría es un método de análisis óptico, es un instrumento que permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de sustancia, son dispositivos de un solo canal en los que cada elemento del espectro seve consecutivamente y no de forma simultánea. (Skoog, 1994)

Los espectrofotómetros se utilizan para medidas de absorbancia de las regiones ultravioletas, visible e infrarroja y para medidas de fluorescencia en las dos primeras. (Skoog, 1994)
Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energía es absorbida; la energía radiante no puede producir ningún efecto sin ser absorbida. (Glenn, 1967)
Las medidas espectroscópicas de concentración proteica utilizan un espectrofotómetro, en el que una cubeta de grosor ʅ que contiene una solución de la proteína se coloca en un haz de radiación monocromática de intensidad I0. La intensidad del haz emergente disminuirá hasta un valor I porque la solución absorbe parte de la radiación. La absorbancia a la longitud de onda λ se define como Aλ= log (I0/I) y está relacionada con ʅ y la concentración c por la ley de Beer
Aλ = ελ / c
Donde ελ es el coeficiente de extinción a una longitud de onda λ para la sustancia concreta que se estudia. Sus dimensiones dependen de las unidades de concentración empleadas. Si la concentración de proteína se mide en mg/cm3 y con ʅ en cm, entonces ελ debe tener las dimensiones cm2/mg, dado que A es una magnitud sin unidades. En cambio, cuando las concentraciones se expresan en molaridad (M), las unidades de ε pasan a ser M-1 cm-1. Una vez determinado el coeficiente de extinción de una proteína concreta, la concentración decualquier otra solución de esa proteína puede calcularse a partir de una simple medida de absorbancia, utilizando la ecuación. Se emplea habitualmente el mismo método para los ácidos nucleicos, pero en este caso suele utilizarse una longitud de onda de 260 nm, dado que los ácidos nucleicos absorben más intensamente en esa región del espectro. (Mathews, 2002)
La segunda región de fuerte absorción en el espectro de las proteínas se encuentra entre 180 y 220 nm. La absorción de esas longitudes de onda surge de las transiciones electrónicas en el propio armazón polipeptídico, y como consecuencia es sensible a la conformación del armazón. De hecho, ambas regiones del espectro de absorción de las proteínas resultan algo afectadas por el estado conformacional. Los coeficientes de extinción cambian ligeramente cuando una molécula pasa de una forma globular a otra de ovillo aleatorio, porque se modifica el entorno local de todos los grupos, incluyendo las cadenas laterales aromáticas. Dado que la espectroscopia puede utilizarse con gran exactitud, pueden medirse incluso cambios pequeños y puede utilizarse para seguir la desnaturalización proteica. (Mathews, 2002)
En T=P/P0 se representa un haz de radiación paralela, antes y después de haber atravesado una capa de solución de una especie absorbente de concentración c, de b cm de grosor. A causa de la interacción entre los fotones y las partículas absorbentes, lapotencia del haz se atenúa de P0 hasta P. La transmitancia T de la solución es, por tanto, la fracción de la radiación incidente transmitida por la solución. A medida, se expresa la transmitancia como un porcentaje o
% T=P/P0 x 100 (Skoog, 1994).
La absorbancia A de una solución viene definida por la ecuación
A=-log10 T=P0/P. Obsérvese que a diferencia de la transmitancia, la absorbancia de una solución aumenta cuanto mayor es la atenuación del haz (Skoog, 1994).
También la absorbancia y la transmitancia se pueden relacionar de la siguiente manera
A=2+log 1/T ó A=2-log%T
La ley de Lambert-Beer establece la existencia de una relación lineal entre la extinción y concentración siempre que las dimensiones de la cubeta o tubos que contengan las muestras permanezcan constantes. La falta de linealidad puede atribuirse a factores como: luz monocromática defectuosa; factores químicos asociados en la reacción; limitación de la sensibilidad del aparato en la determinación, etc. En algunos casos, especialmente al trabajar con muestras biológicas, la presencia de contaminantes puede disminuir o aumentar la coloración obtenida, para corregir estas pequeñas desviaciones de la ley de Lambert-Beer es necesario incluir “blancos” en los que deben estar presentes todos los reactivos excepto la sustancia problema. (Mathews, 2002)

Objetivos

• Interpretación de un espectro de absorción (espectrograma
• Construcción ycomprensión de una curva de calibración
• Calcular la concentración de una muestra problema, previa construcción de la curva de calibración.

RESULTADOS

PARTE I: PREPARACIÓN DE SOLUCIÓN STOCK DE ANARANJADO DE METILO (A.M.

A. DATOS TEÓRICOS
a_ Concentración de solución stock de A.M. = 10mg%=0,1mg/ml

b_ Concentración de solución diluida de A.M. para el espectro de absorbencia (calculo).
C1 x V1= C2 x V2
0,1mg/ml x V1= 0,005g/ml x 100ml
V1= 5 ml
R: La solución diluida de anaranjado de metilo para el espectro de absorbencia es de 5ml.

C_ Concentración de solución diluida de A.M. para la curva de calibración (calculo
C1 x V1= C2 x V2
0, 1 mg/ml x V1= 0, 01 mg/ml x 100 ml
V1= 10 ml
R: La concentración de solución diluida de A.M. para la curva de calibración es de 10ml.

PARTE II: ESPECTRO DE ABSORCIÓN DEL ANARANJADO DE METILO

A. TABLA DE DATOS EXPERIMENTALES

Tabla I: “Espectro de absorbancia A. Metilo

Longitud de onda (nm) % Transmitancia Absorbancia (D.O.)
400 93.325 0.030 A
420 88.716 0.052 A
440 86.696 0.062 A
460 82.985 0.081 A
480 80.909 0.092 A
500 84.723 0.072 A
520 90.365 0.044 A
540 91.411 0,039 A

Cálculos:
Longitud de onda: 400nm
A = 2 – log %T
0.030 = 2 – log %T
-1.97= - log %T /anti log
93.325= %T

Longitud de Onda: 420nm
A = 2 – log %T
0.052= 2 – log %T
-1.948= - log %T /anti log
88.716= %T
Longitud de Onda: 440
A= 2 – Log % T0.062= 2 – Log % T
-1.938= - log % T
86.696= % T
Longitud de Onda: 460 nm
A= 2 – Log % T
0.081= 2 – Log % T
-1.919= - log % T
82.985= % T

Longitud de Onda: 480 nm
A= 2 – Log % T
0.092= 2 – Log % T
-1.908= - log % T
80.909= % T

Longitud de Onda: 500 nm
A= 2 – Log % T
0.072= 2- Log % T
-1.928= - log % T
84.723= % T

Longitud de Onda: 520 nm
A = 2 – Log % T
0.044= 2 – Log % T
-1.956= - Log % T
90.365= % T

Longitud de Onda: 540 nm
A = 2 – Log % T
0.039 = 2 – Log % T
-1.961= - Log % T
91.411= % T

C. DE ACUERDO CON EL ESPECTROGRAMA:

Absorbancia máxima: 0.092 A
Transmitancia mínima: 80.909
Longitud de onda del trabajo: 480nm

PARTE III: CURVA DE CALIBRACIÓN

A. TABLA DE DATOS EXPERIMENTALES
Tabla II: Curva de Calibración
Tubo Ns % Transmitancia Absorbancia Concentracion
A.M. (mg %)
1 92.897 0.032 0,002
2 85.507 0.068 0,004
3 78.163 0.107 0,006
4 72.111 0.142 0,008
5 67143 0.173 0.01
6 100 0

Calculo:

A = 2 – log %T C1 x V1= C2 x V2
0.032= 2 – log %T 0.01mg/ml x 2ml = C2 x 10ml
-1.968= - log %T /antilog 0,002mg/ml = C2
92.897= %T

A = 2 – log %T C1 x V1= C2 x V2
0.068= 2 – log %T 0.01mg/ml x 4ml = C2 x 10ml
-1.932=- log %T /antilog 0,004mg/ml = C2
85.507= %T

A = 2 – log %T C1 x V1= C2 x V2
0.107= 2 – log %T 0.01mg/ml x 2ml = C2 x 10ml
-1.893= - log %T /antilog 0,006mg/ml = C2
78.163= %T

A = 2 – log %T C1 x V1= C2 x V2
0.142= 2 – log %T 0.01mg/ml x 4ml = C2 x 10ml
-1.858= - log %T /antilog 0,008mg/ml= C2
72.111= %T

A = 2 – log %T C1 x V1= C2 x V2
0.173= 2 – log %T 0.01mg/ml x 2ml = C2 x 10ml
-1.827= - log %T /antilog 0,01mg/ml = C2
67.143= %T

PARTE IV: MUESTRA PROBLEMA
A) N° de Muestra: 3
B) % de Transmitancia: -1.839
C) Absorbancia (D.O): 0.1612
D) Concentración de la solución de Anaranjado de metilo: 0.0092

DISCUSIÓN
La Transmitancia (T) es la relación entre la intensidad de radiación transmitido por una muestra (I) y la intensidad de radiación que incide sobre la muestra (I0), medidos ambos en la misma posición del espectro y con la misma rendija, T = I / I0 Se supone que el haz es de radiación paralela y que incide sobre las superficies planas y paralelas de lamuestra, formando ángulos rectos.
La Absorbancia (A) es el logaritmo en base diez del recíproco de la Transmitancia (T), en el que el disolvente puro es el material de referencia; esto es, A = log10 1/T = - log10 T. Las interacciones electromagnéticas con la materia provocan la absorbancia o emisión de energía EMR a través de la transición de los electrones entre niveles cuánticos o discretos de energía, vibraciones de enlaces, rotaciones moleculares y transición de electrones entre orbitales de átomos y moléculas.
La espectrofotometría de absorción de infrarrojos es adecuada para análisis orgánicos, pues los enlaces en alquenos, esteres, alcoholes y otros grupos funcionales tienen fuerzas muy diferentes y absorben la radiación de infrarrojos en una gran variedad de frecuencias o energías. Esta absorción se refleja en el espectrógrafo en forma de picos. No se deben tomar medidas de absorbancias muy bajas o muy altas puesto que disminuye la exactitud del método.
La absorbancia es adimensional y generalmente se presenta con mínimo tres decimales, algunos instrumentos permiten obtenerla con cuatro decimales. Longitud de onda, distancia entre dos puntos consecutivos de una onda que tienen el mismo estado de vibración. La longitud de onda representa un concepto fundamental en la resolución de cualquier tipo de movimiento ondulatorio, y puede variar de valores muy grandes por ejemplo, cientos de metros para radioondas largas a valores muy pequeños por ejemplo, de millonésimas de millón (10-12) para los rayos gamma. Las crestas y los valles son aquellos lugares en los que el movimiento transversal es máximo. La longitud de onda es la distancia entre dos compresiones o enrarecimientos consecutivos.
Cuando la luz infrarroja de una misma frecuencia incide en una molécula, se produce absorción de energía, por lo que la amplitud de la absorción aumentara con el aumento de intensidad de radiación, lo que producirá generación de calor.
En el gráfico de D.O. vs longitud de onda se puede ver que la absorbancia a cierta longitud de onda (en este caso 480nm) puede alcanzar su máxima expresión, y luego de llegar a ésta comienza a disminuir su absorbancia.
En el gráfico de Transmitancia vs longitud de onda se puede ver que hay un cierto momento en la longitud de onda (en este caso 480nm) en que la Transmitancia alcanza su mínima expresión, pero una vez llegada a ésta comienza nuevamente a subir su Transmitancia
.
En el grafico de absorbancia vs concentración de anaranjado de metilo se puede observar que mientras más alta sea su absorbancia mayor será la cantidad de anaranjado de metilo, o sea, son directamente proporcionales.


CONCLUSIÓN

Los espectrofotómetros de reflectancia miden la cantidad proporcional de luz reflejada por una superficie como una función de las longitudes de onda para producir un espectro dereflectancia.
El funcionamiento de un espectrofotómetro consiste básicamente en iluminar la muestra con luz blanca y calcular la cantidad de luz que refleja dicha muestra en una serie de intervalos de longitudes de onda. Lo más usual es que los datos se recojan según la cantidad que se necesite de intervalos de longitudes de onda (pueden ser de 400 nm hasta unos 600nm). Esto se consigue haciendo pasar la luz a través de un dispositivo monocromático que fracciona la luz en distintos intervalos de longitudes de onda. El instrumento se calibra con una muestra o loseta blanca cuya reflectancia en cada segmento de longitudes de onda se conoce en comparación con una superficie de reflexión difusa perfecta.
El cociente entre la potencia de la radiación que sale de la muestra y la de la que incidió sobre ella, se define como Transmitancia: T = P / P0. La Transmitancia también puede expresarse en tanto por ciento, multiplicando el cociente anterior por 100.
La absorbancia, o densidad óptica, que se define como el logaritmo de la Transmitancia cambiado de signo: A = log (Po / P) = - log T. De acuerdo con estas expresiones, si la muestra no absorbe radiación, P y P0 coinciden, por lo tanto A=0, y se transmite toda la radiación T=1 (100% de Transmitancia). Si, en otro caso, se transmite solo un 1% de radiación (T=0.01), P=P0/100, la absorción de radiación que ha tenido lugar corresponde a A=2. La absorbancia estárelacionada con la concentración de la sustancia, c, por la ley de Lambert- Beer, que se resume con la ecuación: A = ε b c, donde c se expresa en mol/l, b es la longitud del camino óptico y se expresa en cm, y ε es la absortividad molar, propiedad característica de cada sustancia correspondiente a la cantidad de radiación que absorbe a una longitud de onda determinada, siendo sus unidades l mol-1cm-1. Debido a que A y ε varían con la longitud de onda es importante conocer para que longitudes de onda tienen su máximo valor, para ello es necesario obtener previamente el espectro de absorción de la sustancia, lo que se consigue representando gráficamente los valores de absorbancia frente a la longitud de onda expresada en manómetros (nm).
Cuando la luz atraviesa o se refleja en una muestra, la cantidad de luz absorbida es la diferencia entre la radiación incidente (Io) y la transmitida (I). La cantidad de luz absorbida se expresa normalmente como transmitancia o absorbancia, la transmitancia T, se expresa normalmente en el rango de 0-100 %, pero la absorbancia no tiene unidades y varía de 0 a ∞.

BIBLIOGRAFÍA

• Skoog, Douglas A. Leary, James J. “ANALISIS INSTRUMENTAL”. Cuarta edición. 1994. Editorial McGRAW-HILL. México.

• Mathews, Van Holde, Ahern, “BIOQUIMICA”. Tercera edición. 2002. Editorial Addison Wesley. Madrid.

• Glenn H. Brown y Eugene Salle, “Quimica cuantitativa”. 1967. Editorial